Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo
Summary
Questo protocollo presenta un quadro metodologico dettagliato per la transgenesi basata sull’elettroporazione di cellule cardiache in cuori di topo in via di sviluppo. Le risorse video fornite qui faciliteranno l’apprendimento di questa tecnica versatile.
Abstract
Il cuore dei mammiferi è un organo complesso formatosi durante lo sviluppo attraverso popolazioni molto diverse di cellule progenitrici. L’origine, i tempi di reclutamento e il destino di questi progenitori sono vitali per il corretto sviluppo di questo organo. I meccanismi molecolari che governano la morfogenesi del cuore sono essenziali per comprendere la patogenesi delle cardiopatie congenite e della rigenerazione cardiaca embrionale. Gli approcci classici per studiare questi meccanismi hanno impiegato la generazione di topi transgenici per valutare la funzione di geni specifici durante lo sviluppo cardiaco. Tuttavia, la transgenesi del topo è un processo complesso e dispendioso in termini di tempo che spesso non può essere eseguito per valutare il ruolo di geni specifici durante lo sviluppo del cuore. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per l’elettroporazione e la coltura efficienti di cuori embrionali di topo, consentendo alla transgenesi transitoria di valutare rapidamente l’effetto del guadagno o della perdita di funzione dei geni coinvolti nello sviluppo cardiaco. Utilizzando questa metodologia, abbiamo sovraespresso con successo Meis1 nel cuore embrionale, con una preferenza per la trasfezione di cellule epicardiche, dimostrando le capacità della tecnica.
Introduction
Il cuore è il primo organo che si forma durante lo sviluppo embrionale. Questo processo comporta la coordinazione spazio-temporale di varie popolazioni di cellule progenitrici provenienti da aree distinte dell’embrione. Tutto ciò avviene mentre il cuore in via di sviluppo continua a battere e a funzionare, sottolineando la notevole coordinazione necessaria per la sua formazione 1,2,3. Dato il ruolo cruciale del cuore, una stretta regolazione a livello cellulare e molecolare è essenziale per la sua corretta formazione 4,5. Identificare i meccanismi che controllano lo sviluppo del cuore è stato di grande interesse, in quanto sono cruciali per svelare le cardiopatie congenite, che colpiscono un numero considerevole di pazienti in tutto il mondo6. Inoltre, la comprensione dello sviluppo cardiaco è fondamentale per decifrare la rigenerazione cardiaca, poiché i cuori dei mammiferi postnatali conservano una capacità rigenerativa che viene persa o ostacolata in età adulta 7,8. Di conseguenza, l’analisi dei regolatori molecolari dello sviluppo cardiaco è fondamentale per far avanzare gli sforzi di ricerca sulle cardiopatie congenite e sulla rigenerazione cardiaca.
Nel perseguimento di questo obiettivo, c’è stata una crescente attenzione allo studio del ruolo dell’epicardio nello sviluppo e nella rigenerazione cardiaca9. L’epicardio è un sottile strato di tessuto mesoteliale che comprende lo strato più esterno del cuore dei mammiferi (Figura 1). Recenti studi hanno dimostrato l’importanza dell’epicardio durante il danno cardiaco, rivelando che questo tessuto è in grado di inviare segnali di proliferazione ai cardiomiociti nella zona interessata per mitigare il danno10,11. Nonostante l’importanza dell’epicardio, la conduzione di ulteriori indagini molecolari è stata messa alla prova dalla sua immensa eterogeneità. Gli esperimenti di RNAseq a singola cellula hanno rivelato l’eterogeneità dell’epicardio, che ospita più sottopopolazioni cellulari con firme trascrittomiche distinte 12,13,14,15,16. Pertanto, una strategia per lo screening dei potenziali regolatori dello sviluppo cardiaco dovrebbe tenere conto della diversità delle cellule progenitrici epicardiche.
In questo senso, l’adattabilità del modello murino alla modificazione genetica ha facilitato l’identificazione di numerosi geni cruciali per lo sviluppo del cuore, consentendo la generazione di linee mutanti con guadagno di funzione (GOF) o perdita di funzione (LOF) di geni specifici. Tuttavia, questi approcci implicano un notevole investimento di tempo e risorse sperimentali; pertanto, non sono pratici quando si valutano i ruoli di un gran numero di geni candidati. Inoltre, i geni dello sviluppo spesso esercitano funzioni pleiotropiche in diversi tessuti o sono necessari per lo sviluppo embrionale precoce, ostacolando l’interpretazione del loro contributo allo sviluppo in un processo specifico. Sebbene sia possibile indirizzare la funzione genica in strutture specifiche o in punti temporali dello sviluppo, ciò di solito richiede l’uso di costruzioni genetiche più complesse, che possono essere difficili da generare o sono generalmente non disponibili.
Per superare queste limitazioni, presentiamo una metodologia per elettroporare cuori embrionali di topo per la transgenesi transitoria (Figura 2). Abbinata alla coltura ex vivo e al cell sorting attivato da fluorescenza (FACS), questa strategia dimostra le sue capacità attraverso il GOF transitorio di Meis1, un gene ben caratterizzato implicato nello sviluppo e nella rigenerazione del cuore 17,18,19. In questo articolo, vengono esplorate anche altre potenziali applicazioni di questa metodologia, e vengono discussi i suoi vantaggi e limiti, nonché rispetto ai protocolli esistenti per la modulazione transitoria dell’espressione genica. Riteniamo che il quadro e gli esempi visivi presentati miglioreranno la comprensione della biologia dell’epicardio durante lo sviluppo e la malattia.
Figura 1: Strati cardiaci embrionali di topo. Diagramma schematico di una vista coronale di un cuore embrionale di topo E13-14. I tre principali strati cellulari del cuore sono rappresentati in giallo (endocardio), rosso (miocardio) e blu (epicardio). Il pericardio è rappresentato da una linea marrone. Le quattro camere del cuore sono abbreviate in LV, ventricolo sinistro; RV, ventricolo destro; LA, atrio sinistro; RA, atrio destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica schematica del protocollo di elettroporazione cardiaca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel complesso, la metodologia qui descritta offre un quadro robusto per l’espressione di costrutti transgenici nell’epicardio in via di sviluppo (Figura 4B), come dimostrato dalla sovraespressione di Meis1 (Figura 4C). Con i costrutti appropriati, questo protocollo può essere utilizzato per valutare transitoriamente l’impatto del guadagno di funzione (GOF) o della perdita di funzione (LOF) di un gene specifico. La LOF può essere implementata nella tecnica tras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione RTI2018-097617-J-I00 dal Ministerio de Ciencia e Innovación spagnolo e da Acción 9 dall’Universidad de Jaén all’O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 dal Ministerio de Ciencia e Innovación spagnolo e dalla sovvenzione H2020-MSCA-ITN-2016-722427 dal programma Horizon 2020 dell’UE a M.T. JMG è stato supportato da una borsa di dottorato del Ministero della Scienza spagnolo e della Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Sia il CNIC che il CBMSO sono sostenuti dal Ministero della Scienza spagnolo, mentre il CNIC è sostenuto dalla Fondazione ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 dilution used |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 dilution used |
| CD1 Wild Type mice | Provided by Animalary Unit (CNIC) | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 dilution used |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 dilution used |
| Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG expression plasmid | Addgene | #89689 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dishes 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri dishes 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Phenol Red | Merck | P3532 | |
| Pipette tips | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 dilution used |
| Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Sterile PBS | Provided and autoclaved by technical unit | ||
| Sucrose | Millipore | 84100 | |
| Tweezer electrodes with variable gap | Nepa Gene | CUY650P5 |
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