Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Çalışmada kullanılan reaktiflerin, plazmitlerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Kullanılan tamponların bileşimi Ek Dosya 1’de verilmiştir. 1. Plazmid hazırlığı Plazmitleri (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) E. coli’de dönüştürün.NOT: Plazmit amplifikasyonu için herhangi bir E.coli suşu kullanılabilir. Bazı plazmitler için, NEB stabil gibi özel yetkin hücreler plazmit verimini artırabilir. Bu protokolde kullanılan üç plazmit pAAV-GOI’dir: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 ve pAAV-Cap: pAAV-RC6. Uygun seçici antibiyotikleri içeren LB ortamında optimal hacimde 37 ° C’de 16-18 saat boyunca bakteri üremelidir.NOT: NEB kararlı hücreleri kullanırken, 18-20 saat boyunca 30 ° C’de kültürleyin. E. coli’yi santrifüjleyerek plazmit DNA’sını hasat edin. 4000 x g, 4 °C’de 15 dakika boyunca kültür ortamı. Süpernatan sıvıyı santrifüj şişesinden dikkatlice bir atık kabına dökün ve plazmit DNA’yı peletten büyük ölçekli bir endotoksin içermeyen plazmit saflaştırma kiti ile saflaştırın.NOT: Yavaşça döktüğünüzden ve sıçramasını önlediğinizden emin olun. Bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçün.NOT: OD260 / OD280 oranını kontrol ederek DNA saflığını kontrol edin. Saf DNA oranı yaklaşık 1.8’dir. Daha sonraki ko-transfeksiyon aşaması için DNA konsantrasyonu 1 μg/μL’nin üzerinde olmalıdır. Bir kriyoviyalde 500 μL gliserole 500 μL gece kültürü ekleyerek bakteriyel gliserol stokları yapın ve -80 °C’de saklayın. 2. HEK293T hücrelerinin hazırlanması % 10 FB HEK293T S içeren DMEM yüksek glikoz ortamlı hücreleri 10 katmanlı bir hücre fabrikasına (CF10) tohumlayın ve hücrelerin gece boyunca inkübatörde büyümesine izin verin.NOT: Sağlam AAV üretimi için en uygun koşula sahip olmak için 293T hücrelerinin geçişleri 10’dan az olmalıdır. Mümkünse, şu anda kültür ortamına antibiyotik eklemeyin. CF10, 150 mm’lik bir hücre kültürü kabının yaklaşık 42 katı büyüme yüzey alanına sahiptir. Hücre büyümesini mikroskop altında kontrol etmek için aynı hücre yoğunluğunu 150 mm’lik bir hücre kültürü kabına tohumlayın. 1075 mL hücre süspansiyonu hazırlayın, 150 mm’lik bir tabağa 25 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve kalanını CF10’a ekleyin. Transfeksiyondan önceki ertesi gün hücre birleşmesini kontrol edin.NOT: Hücreler, mikroskop altında gözlemleyerek transfeksiyon anında -90 birleşme noktasına ulaşmalıdır. 3. AAV plazmitlerinin üçlü transfeksiyonu CF10 başına 2.5-5 mg toplam DNA ile 1.2: 1: 1 molar orana sahip olmak için gereken her bir plazmitin miktarını (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-serotip) hesaplayın.NOT: Üç plazmitin molar oranı, optimal transfeksiyon etkinliği için değişken olabilir. Bu CF10 ayarına geçmeden önce küçük ölçekli bir ayarda test etmek daha iyidir. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 ve pAAV-RC6, örnek olarak AAV6-CMV-GFP virüsünü yapmak için kullanılır. PEI hesap makinesi formülü Tablo 1’de listelenmiştir. 350 mL OptiMEM’i 500 mL’lik steril bir şişeye koyun. Üç plazmit DNA’sını da Opti-MEM içeren şişeye ekleyin. İyice karıştırın. 15 mL 1 mg / mL polietilenimin (PEI) çözeltisi (1: 3 μg DNA / μg PEI oranı) ekleyin. OptiMEM/DNA/PEI karışımını 30 saniye boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı çalkalayın.NOT: Baloncuk yapmakta bir sakınca yoktur. Karışımı oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.NOT: Daha uzun inkübasyon, transfeksiyon verimliliğini azaltabilir. OptiMEM/DNA/PEI solüsyonunu, 10 mM HEPES ve% 2 FBS ile 700 mL DMEM düşük glikoz içeren 1 L’lik şişeye ekleyin. İyice karıştırın.NOT: Bu çalışmada, DMEM’deki düşük glikoz, ko-transfeksiyondan sonra daha iyi AAV vektör üretimi göstermiştir. HEPES ilavesi, hücrelerin daha iyi bir durumda kalmasına yardımcı olur. Şişeyi yavaşça çevirerek karıştırın. Çok fazla baloncuk oluşturmaktan kaçının. CF10’u inkübatörden çıkarın ve ortamı bir atık kabına vakumlayın.NOT: CF10’u kaputun içindeki yüzeye koyun ve bir tarafını kademeli olarak yukarı kaldırın, hücreleri ayırmadan ortamı yavaşça vakumlayın. Transfektan karışımını dikkatlice CF10’a ekleyin. On katmanın tamamının ortamla kaplandığından emin olun.NOT: 150 mm’lik tabağa 25 mL transfektant karışımı ekleyin. Hücreleri hasada kadar günlük olarak izleyin. Kalan transfektant karışımını yavaşça dökerek CF10’a ekleyin. CF10’u çok dikkatli bir şekilde döndürün ve her katman için eşit hacim sağlayın. CF10’u 72-96 saat boyunca inkübatöre geri koyun.NOT: AAV vektörlerinin ne zaman hasat edileceğine karar vermek için 150 mm’lik monitör çanağını kontrol edin. Hücreler tam bir AAV yükü ile çok kolay bir şekilde ayrıldığında, hasat zamanı gelmiştir. 4. AAV vektörlerinin toplanması CF10’u kuvvetlice çalkalayarak transfeksiyondan 3-4 gün sonra virüsü hasat edin. Ortamı 250 mL’lik konik tüplere dökün ve virüsü 4 °C’de 20 dakika boyunca 4000 x g’da döndürün.NOT: Bu protokolde kullanılan AAV6 serotipi için, AAV çoğunlukla peletteki hücresel materyale bağlı kalacaktır. Ve ‘lik AAV medyaya gizlendi. Bu oranlar diğer AAV serotipleri için farklılık gösterebilir. Arıtılmış süpernatanı 0,45 μm filtre ünitesi ile filtreleyin ve yağış için saklayın. CF10’u 500 mL DPBS 1x tampon ile durulayın ve 4000 x g’da 4 °C’de 20 dakika santrifüjleyin. Bir vakum sistemi ve aspirasyonlu bir pipet kullanarak süpernatanı atın. Saflaştırmaya kadar -80 ° C’de CF10 başına 20 mL AAV lizis tamponu ekleyin.NOT: Daha sonra AAV ekstraksiyonu için AAV lizatını 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın. Filtrelenmiş süpernatanı çıkarın,% 8’lik bir nihai konsantrasyon için% 40 PEG-2.5 M NaCl çözeltisi ekleyin ve en az 3 saat veya gece boyunca bir orbital döndürücü üzerinde soğuk bir odada inkübe edin.NOT: 100 mL süpernatan için 25 mL PEG-2.5 M NaCl çözeltisi ekleyin. Virüsü 4000 ° C’de 30 dakika boyunca 4 x g’da santrifüjleyerek çökeltin.NOT: Karışımı santrifüjleme için 250 mL konik tüplere aktarın. Süpernatanı çıkarmak için aspirat edin ve peletleri askıya almak için 5-10 mL AAV HEPES yeniden süspansiyon tamponu ekleyin. Aşağı akış saflaştırmasına devam etmek için 50 mL’lik konik bir tüpe aktarın veya -80 °C’de saklayın. 5. AAV ekstraksiyonu Virüs peletini 37 °C’lik bir su banyosunda 10-15 dakika çalkalayıcı ile çözdürün.NOT: AAV lizatını tamamen erimesi için girdaplayın. -80 °C 0 etanol banyosunda 20-30 dakika dondurun.NOT: Alternatif olarak, dondurma döngüsü kuru buzla çevrili soğuk bir 0 etanol kabı ile yapılabilir. 3-4 kez donma/çözülme yapın ve gerekirse arada girdap yapın.NOT: Bu döngü, dondurma adımında duraklatılabilir. AAV lizatını aşağı akış çalışmasına kadar -80 °C’de saklayın. AAV lizatını (adım 5.3’ten itibaren) ve yeniden askıya alınan AAV’yi (adım 4.7’den itibaren) 37 ° C’lik bir su banyosunda 10-15 dakika boyunca bir çalkalayıcı ve girdap ile çözün.NOT: Tamamen eridiğinden ve karıştırdığından emin olun. AAV lizatına Benzonaz nükleaz (250 birim / μL) ekleyin ve 50 birim / mL’lik bir nihai konsantrasyon için AAV’yi yeniden süspanse edin. Çözümü girdap. 37 °C’lik bir su banyosunda 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.NOT: Çözünmesi, ısınması ve iyice karışması için zaman tanımak için bir su banyosunda% 10 sodyum deoksikolat alikotlarını çıkarın. %0,5’lik bir nihai konsantrasyon için sodyum deoksikolat ekleyin ve 37 ° C’de bir çalkalayıcı ile 30 dakika inkübe edin.NOT: Hücrelerden AAV salınımını arttırmak için sodyum deoksikolat kullanıldı. Ham AAV çözeltisini 2 mL santrifüj tüplerine dağıtın ve 4 ° C’de 10 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleyin. Süpernatanı 50 mL’lik konik bir tüpe aktarın.NOT: Süpernatanı aktarmak için 1 mL’lik bir pipet kullanın. Peletleri atın. Eşit miktarda kloroform ekleyin ve 1-2 dakika girdaplama yaparak AAV’yi çıkarın.NOT: Çözelti opak, beyaz, süt benzeri olmalıdır. Sütlü çözeltiyi 2 mL’lik santrifüj tüplerine aktarın ve eşit şekilde dağıtın. 4 ° C’de 10 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleyin. Üst pembe tabakayı dikkatlice pipetleyin ve 50 mL’lik yeni bir konik tüpe aktarın.NOT: Kloroform/protein katmanlarını rahatsız etmeyin. Bir pipet kullanarak son hacmi ölçün. Ham AAV-PEG-Sülfat hacim tablosuna (Tablo 2) göre, uygun hacimlerde (NH4)2 S04 ve PEG çözeltisini karıştırın. 2 dakika boyunca girdap. Karışımı eşit şekilde dağıtmak için 2 mL santrifüj tüplerine aktarın. 4 °C’de 10 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleyin 22 G’lık bir iğne ve 3 mL’lik bir şırınga kullanarak alt tabakayı toplayın. AAV’yi 50 mL’lik bir konik tüpte toplayın ve daha sonra iyodiksanol gradyanları ultrasantrifüjlemesi için 4 ° C’de saklayın. 6. İodyiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile AAV saflaştırma Kullanılan ultrasantrifüj tüplerinin sayısına göre AAV’yi yüklemeden önce iyodiksanol gradyanlarını taze olarak hazırlayın (Tablo 3).NOT: Katmanları gözlemlemek için fenol kırmızısı kullanılmıştır. Her bir çözeltiyi, 16 G’lik uzun bir iğne ile tutturulmuş 10 mL’lik bir şırınga kullanarak yavaşça yuvarlak tepeli polipropilen ultrasantrifüj hızlı sızdırmaz bir tüpe yerleştirin. Baloncuklardan kaçının. 22 G’lik bir şırınga ile gradyanın üzerine dikkatlice 17 mL’ye kadar AAV çözeltisi ekleyin. Tüpü doldurmak için AAV diyaliz tamponu kullanın.NOT: Ultrasantrifüj tüpündeki duvara damla yükleyerek AAV çözeltisini ekleyin. Degrade katmanlarını rahatsız etmeyin. Ultrasantrifüj tüplerini elektrikli bir sızdırmazlık maddesi ile kapatın.NOT: Tüpleri ultrasantrifüje göndermeden önce ±0,2 g farkla dengeleyin. 4 °C’de bir Ti70 rotorunda 2 saat boyunca 350.000 x g’da santrifüjleyin. Tüpleri rotordan dikkatlice çıkarın ve ultrasantrifüj tüpleri rafına yerleştirin.NOT: Degradelerin bozulmadığından emin olun. Aşağıdaki adımları izleyerek AAV kesirlerini toplayın:Tüpü bir stand tutucu üzerinde sabitleyin. Ultrasantrifüj tüplerini 10 mL’lik bir şırıngaya bağlı 19 G’lık bir iğne ile -60’lık arayüzün biraz altına delin.NOT: İğnenin açıklığı yukarı bakacak şekilde eğime bakacak şekilde olmalıdır. 16 G’lik bir iğne ile tüpün üstüne bir delik açın. Tüp başına 5 mL’ye kadar toplayın. Protein kontaminasyonunu -40 arayüzde toplamaktan kaçının. Her ultrasantrifüj tüpü için tekrarlayın.NOT: AAV fraksiyonlarını 50 mL’lik konik bir tüpe aktarın. 7. İkinci tur iyodiksanol gradyanları ultrasantrifüjleme NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Bu adım, daha yüksek kaliteli bir tam AAV kapsid için boş AAV oranını azaltmaktır. AAV’yi >1: 1’i AAV diyaliz tamponu ile seyreltin.NOT: Ultrasantrifüjlemenin ilk turundan toplanan AAV, iyodiksanol tabakasındaydı. ‘luk iyodiksanol tabakasının üzerine yüklenebilmesi için en az oranında seyreltilmesi gerekir. Her bir çözeltiyi (Tablo 4) 16 G’lik bir iğne kullanarak bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin ve yavaşça 10 mL’lik bir şırınga takın. Baloncuklardan kaçının. 22 G’lik bir şırınga ile gradyanın üzerine dikkatlice 20 mL seyreltilmiş AAV çözeltisi ekleyin. Tüpü doldurmak için AAV diyaliz tamponu kullanın. 6.4 ile 6.7 arasındaki adımları tekrarlayın. 8. AAV diyalizi ve konsantrasyonu Yeni bir 18 G iğne ve 10 mL şırınga kullanarak AAV virüsünü diyaliz kasetine aktarın. Virüsü yavaşça kasete enjekte edin ve içindeki havayı çıkarın. AAV diyaliz tamponu içeren behere bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakasına yerleştirin. Diyaliz kasetini bir şamandıra şamandırası ile diyaliz tamponuna koyun. 4 °C’de karıştırın. AAV diyaliz tamponunun 2-3 katını değiştirin.NOT: Kasetin yüzmesine ve arabellek değişimini gerçekleştirmesine izin vermek için yeterli arabellek kullanın. Beheri alüminyum folyo ile örtün. 18 G’lik bir iğne ile tutturulmuş 10 mL’lik bir şırınga kullanarak, virüsü kasetten bir santrifüj filtre ünitesine toplayın. 4,000 x g’da 4 ° C’de 15-30 dakika santrifüjleyin.NOT: AAV’yi AAV diyaliz tamponu ile 2-3 kez çalın. AAV’yi filtrenin üstünde kalan ~200 μL olana kadar konsantre edin. Konsantre AAV’yi filtre ünitesinden toplayın. Filtreyi başka bir 300 μL AAV diyaliz tamponu ile durulayın ve konsantre AAV’ye aktarın. 1 mL tüberkülin luer kayma şırıngası kullanarak virüsü 0.22 μm’lik bir şırınga filtresinden süzün. En az hacim kaybını sağlamak için, havayı filtreden 2-3 kez itmek için 10 mL şırıngayı kullanın. Saflaştırılmış AAV virüsünü titrasyon için geçici olarak 4 °C’de saklayın.NOT: Virüsü titre edin, alikotlayın ve 1 hafta içinde -80 °C’de saklayın. 9. AAV virüsü titrasyonu NOT: Saflaştırılmış AAV’yi titre etmek için TaqMan kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanıldı. AAV vektörlerini DNaz I ile muamele edin ve 37 ° C’de 30 dakika inkübe edin, ardından 95 ° C’de 10 dakika inkübe edin.NOT: 10 μL reaksiyona örnek olarak 2 μL AAV virüs örneği, 1 μL DNaz, 1 μL DNaz tamponu ve 6 μL H2Okullanılır. PCR tüplü bir termodöngüleyicide gerçekleştirilebilir. AAV ekleme bölgesini hedefleyen astar setlerini hazırlayın.NOT: Hedefler, AAV yapısındaki destekleyici, transgen ve raportör olabilir. Primerler Tablo 5’te listelenmiştir. DNA plazmid standartlarını (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ve 0.0001 pg/μL) ve negatif bir kontrol (H2O) hazırlayın. Primerler de dahil olmak üzere qPCR ana karışımını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Standartları ve numuneleri üç nüsha halinde bir PCR plakasına yerleştirin. qPCR karışımını standartlara ve numunelere ekleyin. Plakayı kapatın ve üreticinin talimatlarına göre qPCR reaksiyonunu gerçekleştirin.NOT: Reaksiyon koşulları malzemelere/reaktiflere ve alete bağlıdır. Hızlı ve konvansiyonel PCR döngüleri uygulanabilir. AAV virüs titresini hesaplayın.NOT: Bu protokoldeki numune konsantrasyonu, orijinal numunelerden 1/10 seyreltmedir. AAV virüsünü 1.5 mL’lik tüplerde alın ve bir aya kadar 4 ° C’de saklayın ve uzun süre -80 ° C’de saklayın.NOT: Depolama için donma/çözülme döngülerinden kaçının. İn vivo deneyler için kullanıldığında, iki kez alikottan fazla çözülme kullanmayın. 10. AAV’nin kalite kontrolü NOT: AAV virüsleri, bir SDS-PAGE jeli kullanılarak SDS-PAGE gümüş lekesi ile saflık açısından karakterize edildi ve ticari olarak temin edilebilen bir boyama kiti kullanılarak boyandı. 3 x 109 vg AAV virüs örneğini Laemmli tamponu ile denatüre edin.NOT: Kontrol olarak bir referans AAV virüsü kullanın. AAV6-CMV-GFP referanslı tam kapsid kullanılır. Denatüre AAV’yi %4-20 gradyanlı bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve 50 dakika boyunca 180 V’ta çalıştırın. Jeli elektroforez plakasından çıkarın. Jeli, üreticinin talimatlarına göre gümüş bir boyama kiti ile boyayın. AAV kapsid proteinleri VP1, VP2 ve VP3’ü kontrol edin.NOT: Saf AAV virüsü yalnızca VP1, VP2 ve VP3 kapsid proteini içerir. Saf değilse, jel üzerinde diğer protein bantları görülebilir.NOT: Morfolojik bütünlüğü ve dolu/boş oranını değerlendirmek için negatif boyanmış rekombinant AAV viryonlarının transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yapıldı. Bir cımbızla bir EM ızgarası alın ve ızgaranın parlak tarafı yukarı bakacak şekilde bankın üzerine koyun. 5 μL AAV örneğini ızgaraya pipetleyin ve buharlaşarak kurumasını bekleyin.NOT: Gerekirse AAV’yi seyreltin. 1012 vg/mL ortalama bir titredir. Izgaranın kuruması 30-60 dakika sürebilir. Izgarayı, ızgara üzerine yaklaşık 200 μL H2O ile damla damla pipetleyerek yıkayın. Izgaranın yanına dikey olarak bir kromatografi kağıdını yavaşça yerleştirerek fazla suyu alın. Izgaraya 5 μL% 2 Uranil Asetat çözeltisi pipetleyin. 5 dakika inkübe edin ve yukarıda belirtildiği gibi fitilleyin. Izgaranın kurumasını bekleyin. AAV parçacıklarını bir transmisyon elektron mikroskobu altında (50.000 kat büyütmede) görselleştirin. Viral genoma sahip viral kapsidler homojen beyaz altıgenler olarak görünürken, boş kapsidler beyaz kenarlı ancak koyu renkli bir merkeze sahip altıgenler olarak görünecektir. Tam vs’nin yaklaşık yüzdesini belirlemek için en az 100 parçacığı rastgele sayın. boş AAV parçacıkları.