신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비
Summary
이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.
Abstract
성체 쥐에서 골수를 분리하기 위한 다양한 기술이 잘 확립되어 있습니다. 그러나 신생아 마우스에서 골수를 분리하는 것은 어렵고 시간이 많이 걸리지만, 일부 모델의 경우 번역학적으로 관련성이 있고 필요합니다. 이 프로토콜은 7-9일 된 새끼의 골수 세포를 준비하기 위한 효율적이고 간단한 방법을 설명합니다. 그런 다음 이러한 세포를 추가로 분리하거나 특정 관심 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 대식세포는 염증과 감염에 중요한 역할을 하는 중요한 면역 세포입니다. 발달 과정에서 신생아 대식세포는 조직 리모델링에 크게 기여합니다. 또한, 신생아 대식세포의 표현형과 기능은 성인 대식세포의 표현형과 기능이 다릅니다. 이 프로토콜은 또한 L929 컨디셔닝 배지가 있는 상태에서 분리된 골수 세포와 신생아 대식세포의 분화를 설명합니다. 분화된 신생아 대식세포에 대한 표면 마커는 유세포 분석을 사용하여 평가되었습니다. 기능성을 입증하기 위해 phagocytic efficiency는 pH 민감성 염료 접합 Escherichia coli를 사용하여 테스트했습니다.
Introduction
골수는 조혈모세포군과 중간엽줄기세포 집단을 모두 둘러싸고 있으며, 이들은 자가 재생이 가능하고 다양한 세포계로 분화할 수 있습니다. 골수에 있는 조혈모세포는 골수성 및 림프구 계통을 생성한다1. 중간엽 줄기세포는 골아세포(뼈), 지방세포(지방) 또는 연골세포(연골)를 생성합니다2. 이 세포는 유전자 치료 3,4를 포함하여 세포 생물학 및 조직 공학 분야에서 여러 응용 분야를 가지고 있습니다. 골수에 존재하는 전구 세포는 계통 특이적 성장 인자의 존재 하에 특정 세포 유형으로 분화합니다. 에리트로포이에틴(Erythropoietin)은 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)의 증식을 촉진하고, 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)는 호중구 집락의 성장을 촉진하며, 트롬보포이에틴(thrombopoietin)은 혈소판 생성을 조절하는 계통 특이적 성장 인자(lineage-specific growth factor)의 몇 가지 예이다5. FACS 및 MACS(magnetic-activated cell sorting)로 표시된 세포 표면 항원은 특정 골수 유래 세포 유형의 분리 및 정제를 위한 잘 정립된 방법입니다6.
신생아 사망의 원인을 찾고 조산 중 합병증을 해결하기 위해 신생아 연구가 진행되고 있지만, 직접적인 치료법 개발은 여전히 충족되지 않은 의학적 수요로 남아 있습니다. Smith와 Davis는 “소아 환자들은 여전히 치료적 고아로 남아 있다”고 말했다.7. 신생아를 대상으로 한 임상시험에서 작은 표본, 결과의 평생 영향, 동의를 얻는 데 있어 윤리적 문제 등 여러 가지 어려움이 있다8. 따라서 번역 관련성을 달성하기 위해 신생아에 특화된 in vivo 및 in vitro 연구 모델에 대한 수요가 높습니다. 해부학적 수준과 조직 수준, 짧은 임신 기간, 새끼 크기 사이의 유사성 때문에 설치류는 가장 많이 연구된 포유류 모델 시스템입니다.
여기에서는 7-9일 된 새끼 쥐에서 골수를 분리하고 대식세포로 분화하는 능력을 위한 상세하고 실현 가능하며 재현 가능한 절차를 설명합니다. 그러나 뚜렷한 분화 신호를 사용하여 다양한 세포 계통을 얻을 수 있습니다. 또한 세포 표면 마커의 존재와 골수 유래 대식세포(BMDM)에 대해 예상되는 체외 식세포 활성의 존재를 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신생아 마우스 모델과 관련된 연구는 여러 가지 과제를 제시할 수 있습니다. 신생아는 성인에 비해 독특한 면역 체계가 발달하고 있다8. 따라서 성체 동물 모델에서 생성된 데이터는 신생아에게 적용되는 것으로 가정해서는 안 되며, 여러 출판된 연구에서 이 아이디어를 잘 표현했습니다18,19. 따라서 신생아 특이적 모델과 세포의 출처…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)[R01 AI163333]의 지원을 받아 CMR에 제공되었다. WV CTSI 보조금 GM104942, 종양 미세환경 CoBRE 보조금 GM121322 및 NIH 보조금 OD016165 통해 West Virginia University Flow Cytometry 및 Single Cell Core Facility에 제공된 추가 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
References
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
- Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
- Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
- Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957 (2021).
- Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566 (2023).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
- Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
- Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
- Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
- Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
- Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
- de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).
