Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo
Summary
Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.
Abstract
Varie tecniche per isolare il midollo osseo da topi adulti sono state ben consolidate. Tuttavia, isolare il midollo osseo da topi neonati è impegnativo e richiede tempo, ma per alcuni modelli è rilevante e necessario dal punto di vista traslazionale. Questo protocollo descrive un metodo efficiente e semplice per preparare le cellule del midollo osseo da cuccioli di 7-9 giorni. Queste cellule possono quindi essere ulteriormente isolate o differenziate in specifici tipi di cellule di interesse. I macrofagi sono cellule immunitarie cruciali che svolgono un ruolo importante nell’infiammazione e nell’infezione. Durante lo sviluppo, i macrofagi neonatali contribuiscono in modo significativo al rimodellamento dei tessuti. Inoltre, il fenotipo e le funzioni dei macrofagi neonatali differiscono da quelli delle loro controparti adulte. Questo protocollo delinea anche la differenziazione dei macrofagi neonatali dalle cellule isolate del midollo osseo in presenza di terreno condizionato con L929. I marcatori di superficie per macrofagi neonatali differenziati sono stati valutati utilizzando l’analisi citofluorimetrica. Per dimostrare la funzionalità, l’efficienza fagocitaria è stata testata anche utilizzando Escherichia coli coniugato con colorante sensibile al pH.
Introduction
Il midollo osseo racchiude popolazioni di cellule staminali ematopoietiche e mesenchimali che sono auto-rinnovabili e possono essere differenziate in varie linee cellulari. Le cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo danno origine a linee mieloidi e linfoidi1. Le cellule staminali mesenchimali producono osteoblasti (ossa), adipociti (grasso) o condrociti (cartilagine)2. Queste cellule hanno molteplici applicazioni nel campo della biologia cellulare e dell’ingegneria tissutale, compresa la terapia genica 3,4. Le cellule progenitrici presenti nel midollo osseo si differenziano in tipi cellulari specifici in presenza di fattori di crescita specifici del lignaggio. L’eritropoietina promuove la proliferazione delle cellule progenitrici eritroidi, il fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) stimola la crescita delle colonie di neutrofili e la trombopoietina regola la produzione di piastrine come alcuni esempi di fattori di crescita specifici del lignaggio5. Il FACS marcato con antigene di superficie cellulare e il sorting cellulare attivato magneticamente (MACS) sono metodi consolidati per l’isolamento e la purificazione di specifici tipi di cellule derivate dal midollo osseo6.
Sebbene gli studi neonatali stiano avanzando verso la ricerca delle cause delle morti neonatali e l’affrontare le complicanze durante le nascite premature, lo sviluppo terapeutico diretto rimane un’esigenza medica insoddisfatta. Smith e Davis affermarono: “I pazienti pediatrici rimangono orfani terapeutici”7. Ci sono diverse sfide, come piccoli campioni, effetti permanenti del risultato e questioni etiche nell’ottenere il consenso negli studi clinici sui neonati8. Pertanto, c’è una forte domanda di modelli di studio in vivo e in vitro specifici per i neonati per ottenere rilevanza traslazionale. A causa delle somiglianze tra i livelli anatomici e tissutali, i brevi periodi gestazionali e le dimensioni della cucciolata, i roditori sono il sistema modello di mammifero più studiato.
Qui, descriviamo una procedura dettagliata, altamente fattibile e riproducibile per isolare il midollo osseo da cuccioli di topo di 7-9 giorni e la loro capacità di differenziarsi in macrofagi. Tuttavia, una varietà di linee cellulari potrebbe essere ottenuta con l’uso di segnali di differenziazione distinti. Dimostriamo anche la presenza di marcatori di superficie cellulare e la presenza di attività fagocitaria in vitro attesa per i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM).
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricerca che coinvolge modelli murini neonatali può presentare una serie di sfide. I neonati hanno un sistema immunitario in via di sviluppo unico rispetto agli adulti8. Pertanto, i dati generati da modelli animali adulti non dovrebbero essere considerati applicabili ai neonati, e diversi lavori pubblicati hanno articolato bene questa idea 18,19. Pertanto, sono necessari modelli e fonti di cellule neonatali specifici per studiare le com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R01 AI163333] per CMR. Riconosciamo l’ulteriore sostegno finanziario fornito alla West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility dalle seguenti sovvenzioni: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 e NIH grant OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
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