Регистрация мышечной активности передних конечностей у мышей с фиксированной головой с помощью хронически имплантированных электродов ЭМГ

Все эксперименты и процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями NIH и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Северо-Западного университета. В других странах и/или учреждениях могут действовать другие правила, требующие внесения изменений в эту процедуру. В настоящее исследование были включены взрослые самцы C57BL6/J (см. таблицу материалов) в возрасте 12-20 недель с минимальной массой тела 20 г. 1. Изготовление электродного комплекта ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эти действия на чистом столе с использованием стереомикроскопа с диапазоном увеличения 10x-40x и чистыми голыми руками. На рисунке 1 приведены схемы с подробным описанием зачистки электродного провода (рисунок 1A) и сборки разъема (рисунок 1B). Отрежьте провода: Для каждой пары электродов отрежьте два куска плетеной проволоки из нержавеющей стали с покрытием PFA (7 жил, диаметр 0,0055 дюйма) (см. Таблицу материалов). Для мышц плеча обрежьте каждую проволоку длиной 9,5 см. Для мышц нижней части руки обрежьте каждую проволоку длиной 10,5 см. Свяжите две проволоки вместе одним узлом – он станет узлом, расположенным сразу за пределами места введения (проксимальный узел) при имплантации. Связанные провода составляют одну пару электродов.С помощью иглы 18 G, вставленной в кусок гофрокартона, расположите узел на расстоянии 6 см от вводимого конца и затяните вокруг иглы, притянув нити электродов к картону. Вставной конец уменьшится примерно до 5,5 см, а оставшиеся 0,5 см будут завязаны в узел. Осторожно извлеките иглу и дважды затяните узел голыми руками, чтобы затянуть еще больше.ПРИМЕЧАНИЕ: Узел не должен быть максимально тугим; Затягивание таким образом приведет к образованию проксимального узла, который имеет правильный размер для закрепления имплантированных электродов в ткани. Для мышц плеча убедитесь, что концы соединителей имеют длину 3,5 см. Для мышц нижней части руки убедитесь, что длина концов соединителя составляет 4,5 см. Снимите 0,5 мм изоляции с каждого провода: 1-1,5 мм от узла на одном проводе и 2-2,5 мм от узла на другом проводе. На рисунке 1 показано, где следует зачищать каждый провод.Натяните электрод на листе плоского картона так, чтобы два концевых провода соединились вместе, а вставные концевые провода раздвинулись. С помощью скальпеля сделайте зазубрины в утеплителе, отметив торцы, где будет сниматься изоляция. На каждой надрезе сделайте серию из ~6 надрезов скальпельным лезвием на каждой зазубринах: ~2 сверху, ~2 сбоку и ~2 под проволокой.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно не обрезать сам провод слишком сильно. В противном случае пряди могут порваться. Требуется практика, чтобы достичь соответствующего давления, чтобы полностью разрезать изоляцию с ограниченным повреждением провода. Поверните электродную пару на 180 градусов и повторите 6 надрезов в каждой зазубрине. При необходимости сделайте дополнительные надрезы, чтобы отделить 0,5 мм изоляции от основного провода. Количество необходимых здесь надрезов будет зависеть от приложенного давления и остроты лезвия скальпеля. Наклоните лезвие скальпеля так, чтобы разрезать вдоль ослабленную изоляцию вдоль и снимите ее с провода с помощью щипцов. Осмотрите оголенный провод на предмет обрыва и/или изношенной изоляции, которые могут привести к повреждению при введении в ткань. Снимите 1 мм с конца каждого провода на конце разъема. Снимите 5 мм с конца каждого провода на вводящем конце. Скрутите отрезки вводного концевого провода вместе и сожмите открытые на 5 мм концы вместе в валу диаметром 0,5 дюйма. 27 г иглы. Типичные иглы для подкожных инъекций можно использовать после удаления окончания замка Люэра. Повторите шаги 1.1-1.6 для каждой пары электродов. Соберите разъем.Отрежьте гнездовой конец 12-контактного разъема (см. Таблицу материалов) до размера: # пар электродов x 2-контактные слоты. Аккуратно снимите латунные фитинги с каждого порта разъема (они предварительно прикреплены к 12-контактному разъему) плоскогубцами. Сохраните эти фитинги для следующего шага. Припаяйте каждый открытый на 1 мм конец каждого провода к наружной поверхности одного из лопастей латунного фитинга.ВНИМАНИЕ: При пайке выделяются пары, которые могут вызвать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Наденьте перчатки (или вымойте руки после этого), используйте средства защиты глаз и используйте местное устройство для удаления дыма, чтобы ограничить воздействие.Закрепите латунный фитинг в беззубом зажиме из кожи аллигатора, прикрепленном к ручному инструменту внешней поверхностью одного из его лезвий вверх. Расположите фитинг под микроскопом, чтобы обеспечить высокий визуальный контроль во время пайки. С помощью развернутой скрепки или куска проволоки нанесите небольшое количество флюса, совместимого с нержавеющей сталью, на поверхность лезвия. Нанесите на лезвие достаточное количество припоя, чтобы покрыть нижнюю ~1,5 мм латунного лезвия с помощью узкого конического жала для припоя.ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком большое количество припоя здесь помешает сборке разъема, в то время как слишком малое количество припоя может привести к неадекватному соединению. Имейте под рукой дополнительные латунные фитинги, чтобы при необходимости начать все сначала. Обильно покройте поверхность припоя на лезвии флюсом, совместимым с нержавеющей сталью, но избегайте попадания флюса в пространство между двумя лопастями. Прижмите 1 мм оголенного электродного провода заподлицо с припоем на лезвии и нагрейте припой с утюгом, чтобы закрепить соединение. Осмотрите соединение: большая часть оголенного провода должна быть погружена в припой, а провод должен быть надежно прикреплен к латунному фитингу. Убедитесь, что между двумя лезвиями латунного фитинга не оказался припой – это может затруднить подачу вставки штекерного разъема в дальнейшем. Наконец, убедитесь, что соединение находится заподлицо с латунным лезвием, чтобы на следующем этапе фитинг можно было снова вставить в разъем. С помощью прямых щипцов вставьте каждый припаянный латунный фитинг обратно в разъем, убедившись, что провода каждой пары электродов прилегают друг к другу и не запутываются с другими электродными парами. На рисунке 1B показана ориентация пары одиночных электродов в разъеме.ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальная ориентация слева направо: бицепс (3,5 мм на конце коннектора), трицепс (3,5 мм на конце коннектора), разгибатель лучевой кости (ECR; 4,5 мм на конце коннектора) и длинная ладонь (PL; 4,5 мм на конце коннектора). Отметьте одну сторону маркером или белым цветом, чтобы отслеживать ориентацию соединителя во время имплантации. Обрежьте штекерный 12-контактный разъем до того же размера (# пар электродов x 2), что и гнездовой конец, и подключите его к гнездовому разъему. Если фитинги сместились, их можно снова вставить с помощью прямых щипцов после того, как штекерный соединитель будет установлен. Плоскогубцами удалите выступы, выходящие из латунных фитингов. Покройте пазы для контактов эпоксидной смолой, убедившись, что весь металл или провод рядом с разъемом будет изолирован от ткани.ВНИМАНИЕ: Эпоксидная смола может вызвать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей при длительном воздействии. Надевайте перчатки, защитные очки для глаз и используйте эпоксидную смолу только в хорошо проветриваемом помещении или под местным устройством для удаления дыма. Дайте разъему высохнуть на воздухе не менее 30 минут. Проверьте сопротивление каждой электродной пары и пометьте иглы небольшими цветными сегментами термоусадки для легкой идентификации во время операции.ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление должно быть в пределах 18-50 Ом. Более низкое сопротивление может свидетельствовать о короткой позиции. Более высокое сопротивление может свидетельствовать о слишком большом повреждении жил провода. Однако высокое сопротивление часто проистекает из неидеального соединения между валом иглы и проволокой (выполнено на шаге 1.6), которое может быть решено путем дополнительного обжима в этом месте. Перед имплантацией убедитесь, что в наборе электродов нет волокон и другого мусора. Для этого можно использовать распылительную тряпку. Осмотр под микроскопом может быть полезен для проверки. 2. Операция по имплантации электродов ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается одна хирургическая процедура по имплантации головной пластины и электродов, изготовленных в предыдущем разделе, в трицепсы, бицепсы, разгибатели лучевой кости (ECR) и длинную ладонь (PL). Для последних двух мышц очень трудно имплантировать электрод исключительно в эти отдельные мышцы, не проходя через близлежащие синергетические мышцы. Смотрите обсуждение ниже о предостережениях при попытке изолировать записи от отдельных мышц. Накладки на головы обычно разрабатываются по индивидуальному заказу и изготавливаются для конкретных экспериментов. В настоящем исследовании использовались напечатанные на 3D-принтере пластиковые накладки RIVETS19. Многие проекты накладок на голову с открытым исходным кодом доступны в Интернете через Janelia, Институт Аллена и независимые исследовательские группы. Описанная здесь процедура установки оголовья была успешно применена с титановыми и пластиковыми оголовками. Хирургическое вмешательство должно быть выполнено с помощью стереотаксического инструмента (см. Таблицу материалов) со стереомикроскопом с увеличением в 10-40 раз. Холодом простерилизовать электроды и оголовок с использованием 1,5% глутаральдегида в течение ночи или в течение 8 часов. Перед имплантацией коротко промойте в стерильной воде и дайте полностью высохнуть на воздухе.ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид вреден при проглатывании и может вызвать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Ручка в перчатках в вентилируемом вытяжном шкафу. Индуцировать анестезию 2-4% изофлураном в медицинском кислороде в индукционной камере до потери выпрямляющего рефлекса (примерно 3 минуты) в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами. Перенесите животное к подвижному носовому конусу, чтобы продолжить получение анестезии. Под наркозом с 2% изофлураном в медицинском кислороде перед операцией побрейте голову, шею и конечность животного. Выполните все оставшиеся действия в этом разделе под анестезией. Корректируйте дозировку изофлурана по мере необходимости, чтобы поддерживать частоту дыхания 1 Гц и отсутствие рефлекса на пальцах ног. Наносите глазную смазку и повторно наносите ее каждые 1 час на протяжении всей операции. Вводите инъекционный анальгетик (например, карпрофен, 5 мг/кг) и антибиотики подкожно (например, энрофлоксацин, 10 мг/кг) (см. Таблицу материалов) в начале операции. Имплантируйте оголовье с помощью следующих шагов или альтернативного метода, одобренного учреждением.Закрепите голову животного в ушных планках на стереотаксическом инструменте и обеспечьте анестезию (2% изофлуран) через носовой конус, прикрепленный к стереотаксическому инструменту. Добавьте стерильную простыню для поддержания асептики. Очистите голову и шею с помощью повидон-йодных подушечек и стерильных спиртовых салфеток.При необходимости повторно нанесите смазку для глаз. Введите лидокаин (4 мг/кг) (см. Таблицу материалов) подкожно в область разреза. Обеспечьте адекватную индукцию анестезии, выполнив щипывание пальцев ног. Если выпрямляющий рефлекс отсутствует, сделайте разрез по средней линии головы животного от каудального края глаз до каудального края ушей. Зажмите кожу тканевыми зажимами: по два на ростральном крае с каждой стороны сразу за глазами и два на каудальном крае сразу за ушами. Очистите поверхность черепа, аккуратно соскоблив лезвием скальпеля, чтобы удалить засохшую фасцию. Нанесите тонкий слой стоматологического цемента (см. Таблицу материалов) на поверхность черепа и дайте ему высохнуть в течение 5 минут. Расположите оголовье на черепе животного. Как и где имплантируется оголовье, зависит от оголовья и исследовательского вопроса. Используйте стоматологический цемент для приклеивания оголовья к черепу. Убедитесь, что череп полностью закрыт. Дайте стоматологическому цементу высохнуть в течение 10 минут. Переложите животное на подвижный пластиковый носовой конус, чтобы обеспечить анестезию до конца операции; Это позволит регулярно менять положение животного во время операции для доступа к различным мышцам с сохранением анестезии. Разрез на задней части шеи (сделанный при имплантации оголовья) удлините так, чтобы он достигал 1 см каудально от ушей. С помощью тупого скребка для кости отделите кожу под разрезом на шее от подлежащих тканей, чтобы расчистить путь от разреза на шее к передней конечности, куда будут имплантированы электроды. Временно закрепите разъем ЭМГ на оголовье с помощью небольшого кусочка ленты, чтобы удержать его на месте во время имплантации электрода. Очистите переднюю конечность животного с помощью повидон-йодных прокладок и стерильных спиртовых прокладок. Сделайте разрез на трицепсе.Расположите животное на боку трицепсами вверх. Ввести лидокаин (4 мг/кг) в запланированное место разреза. Это снимет местную боль и сохранит мышцы влажными во время имплантации.ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы должны оставаться влажными, но не мокрыми на протяжении всей операции. Применяйте стерильный физиологический раствор местно по мере необходимости, если мышцы или кожа кажутся сухими. Разрежьте на 7 мм трицепс параллельно кости. Отделите кожу, окружающую разрез, от подлежащих тканей с помощью тупого скребка для кости. Проведите скребком под кожу и вернитесь к разрезу на шее, чтобы освободить путь для электродов. Обрежьте всю фасцию, скрывающую мышцу. Убедитесь, что путь от шеи к трицепсу достаточно большой, вставив закрытые ножницы через разрез трицепса и вытолкнув отверстие для шеи, слегка открыв его после выхода из отверстия. Поднесите электрод трицепса к разрезу трицепса: Вставьте кончик большого игловодителя через разрез трицепса и выйдите из разреза на шее. Зажмите игловодителя вокруг иглы электрода вдоль и протяните до разреза трицепса. Введение трицепса: Следуйте шагу 3 «Введение электродов в мышцы». Сделайте дистальный разрез руки.Положите животное на спину. Обмотайте руку скотчем вдоль бока животного ладонью вниз. Ввести лидокаин (4 мг/кг) в запланированное место разреза. Сделайте разрез на 1 см выше бицепса и ECR от нижней части дельтовидной мышцы до середины нижней части руки, параллельно кости. Дистальный конец разреза должен быть на ~2 мм выше конца мышц нижней части руки. Очистите фасцию, чтобы обнажить двуглавую мышцу. Расчистите путь от дистального разреза руки обратно к разрезу трицепса над (проксимально) крупным кровеносным сосудом, проходящим под кожей плеча. Проведите электрод бицепса под кожу через разрез на шее к разрезу трицепса, затем от разреза трицепса к разрезу дистального отдела руки. Введение бицепса: Следуйте шагу 3 «Введение электродов в мышцы».Снова заклейте руку животного в том же положении, но ладонью вниз. Вставьте как можно ближе к проксимальному концу обнаженного бицепса. Чтобы погрузить электрод хотя бы на 3 мм в мышечную ткань, убедитесь, что он вставлен немного по диагонали к мышечным волокнам в зависимости от размера мыши. Расчистите путь от разреза трицепса к дистальному участку введения руки ниже (дистальнее от) крупного кровеносного сосуда, проходящего под кожей плеча, создавая траекторию, отличную от траектории электрода для бицепса. Введение ECR: Следуйте шагу 3 «Введение электродов в мышцы».Введите в самую проксимальную часть ECR. Выйдите в складке между ECR и его антагонистом и завяжите узел в этой складке. Очистите путь от места введения трицепса к месту введения ПЛ под локтем. Введение PL: Следуйте шагу 3 «Введение электродов в мышцы».Положите животное на спину и заклейте его руку скотчем над головой ладонью вверх. Вставляйте чуть дистальнее локтя. Выходите достаточно проксимальнее сухожилий запястья, чтобы узел в месте выхода лежал на мышце, а не на сухожилиях запястья. Положите животное на бок и зашите разрез трицепса с помощью шелковых швов 6-0. Положите животное на спину и зашите разрез дистального отдела руки с помощью шелковых швов 6-0. Прикрепите соединитель к задней части оголовья с помощью стоматологического цемента. Сшить разрез на шее с помощью шелковых швов 6-0. Нанесите крем с антибиотиком местного действия на места разрезов, чтобы уменьшить воспаление. Наденьте елизаветинский ошейник (см. Таблицу материалов) на животное, чтобы он не потревожил швы во время восстановления. 3. Введение электродов в мышцы Слегка согните иглу (27 G, шаг 1), согнув.Удерживайте иглу иглоотводчиком (см. Таблицу материалов) и прижмите ее к ручке пары щипцов, чтобы добавить изгиб на 5-10 градусов. Добавьте три общих изгиба в разных положениях по длине иглы. Визуализируйте место для входа и выхода из мышцы. Удалите жир и фасции, закрывающие место входа и выхода, разрезав или вытянув тонкими щипцами. Старайтесь избегать повреждения сосудов, чтобы ограничить кровотечение. Стремитесь к 3-5 мм погружной проволоки, проходящей параллельно мышечным волокнам. Это гарантирует, что открытые участки электродной проволоки будут погружены в мышцу. С помощью игловодителя введите иглу в проксимальный конец мышцы, оказывая при этом противодавление тупыми изогнутыми щипцами в другой руке. Протолкните иглу через мышцу к месту выхода. Как только игла выйдет из мышцы, возьмитесь за кончик тупыми щипцами и протяните иглу через него. Продолжайте тянуть, пока проксимальный узел не сядет на место введения. Заведите дистальный узел.С помощью щипцов завяжите свободный узел дистальнее места выхода. Затяните узел до петли длиной 1 см. Надавите на петлю щипцами и расположите ее над местом выхода. Визуализируйте место, где дистальный узел должен быть закрыт до того, как он будет полностью затянут, примерно на 0,5 мм дистальнее места выхода. Аккуратно возьмитесь за петлю тонко изогнутыми щипцами в этом положении и туго натяните петлю на щипцы.ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивайте дистальный узел непосредственно над местом выхода на этом этапе, иначе мышца будет сжата, когда узел будет полностью затянут на следующем этапе. Извлеките тонкие щипцы из узла и завершите затягивание узла, проталкивая узел к месту выхода тонкими согнутыми щипцами и вытягивая конец иглы пальцами. Убедитесь, что проксимальный и дистальный узлы правильно расположены за пределами мест введения и выхода соответственно, чтобы закрепить введенный электрод на месте. Возьмитесь за выходной узел прямыми тонкими щипцами и плотно согните дистальную проволоку вокруг щипцов, чтобы согнуть проволоку вокруг узла и в сторону мышцы/от кожи. Отрежьте проволоку на 0,5 мм дистальнее дистального узла, оставив небольшой бугорок, закрученный вокруг узла.Предыдущий шаг гарантирует, что отрезанный конец бугорка не будет торчать в кожу животного, что может вызвать раздражение. 4. Послеоперационный уход Сразу после операции выполните следующие действия.Размещайте животное поодиночке, чтобы его соседи по клетке не потревожили его швы. Поместите животное в чистую клетку с низкой подстилкой. Удалите все гнезда и материал для обогащения, которые могут помешать подвижности животного во время ношения елизаветинского ошейника. Давайте животному воду и влажный корм, к которому оно может получить доступ во время ношения ошейника. Выполните следующие действия через 24 ч и 48 ч после операции.Снимите елизаветинский ошейник, чтобы животное могло ухаживать за собой в течение 20 минут. Индуцируйте анестезию изофлураном, как указано в шаге 2.2 и шаге 2.3. Вводите инъекционные обезболивающие препараты и антибиотики. Осмотрите места разрезов на предмет отсутствующих швов, открытых ран и признаков инфекции или раздражения. При необходимости замените швы и примените больше местных антибиотиков. Заменяйте влажный корм каждые 48 часов, пока не будет снят елизаветинский воротник. Выполните следующие действия через 6 дней после операции.Проверьте раны на полное заживление. Если раны закрыты, снимите швы. Если раны открыты, подождите еще два дня, чтобы снять швы. Снимите елизаветинский воротник после снятия швов. Верните мышь в новую, чистую клетку с полной подстилкой и обогащением.ПРИМЕЧАНИЕ: Животные могут приступать к экспериментам или лишению воды через 7 дней после операции.