慢性的にEMG電極を移植した頭部固定マウスにおける前肢筋活動の記録

すべての実験と手順は、NIHのガイドラインに従って実施され、ノースウェスタン大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。他の国や機関では、この手順の変更を必要とする異なる規制がある場合があります。本研究に含まれた動物は、12-20週齢のC57BL6/J成人雄( 材料表参照)で、最小体重は20gであった。 1. 電極セットの作製 注意: これらの手順は、10倍から40倍の倍率範囲の実体顕微鏡を使用して、清潔な素手で清潔なベンチトップで実行します。電極ワイヤのストリッピング(図1A)とコネクタアセンブリ(図1B)の詳細を示す図については、図1を参照してください。 ワイヤーの切断:電極ペアごとに、PFAコーティングされた編組ステンレス鋼ワイヤー(7撚り線、直径0.0055インチ)を2本切断します( 材料の表を参照)。上腕の筋肉は、各ワイヤーを9.5cmの長さでカットします。下腕の筋肉の場合は、各ワイヤーを10.5cmの長さで切断します。 2本のワイヤーを1つの結び目で結びます-これは、埋め込まれたときに挿入部位(近位結び目)のすぐ外側にある結び目になります。結束されたワイヤは、1つの電極ペアを構成します。段ボールに18Gの針を差し込んだ状態で、結び目を挿入端から6cmの位置に置き、電極ストランドを段ボールに引っ張って針の周りを締めます。挿入端は約5.5cmに縮み、残りの0.5cmは結び目で結ばれます。 針を慎重に外し、結び目を素手で2回しっかりと引っ張ってさらに締めます。注:結び目はできるだけきつくしないでください。このように締めると、埋め込まれた電極を組織に固定するのに適切なサイズの近位結び目が得られます。 上腕の筋肉の場合、コネクタの端の長さが3.5cmであることを確認してください。下腕の筋肉の場合、コネクタの端の長さが4.5cmであることを確認してください。 各ワイヤから0.5 mmの絶縁体を剥がします:一方のワイヤの結び目から1〜1.5 mm、もう一方のワイヤのノットから2〜2.5 mm。 図 1 は、各ワイヤを被覆する場所を示しています。2つのコネクタ端線を一緒にし、挿入端線を広げて、電極を平らな段ボールにピンと張ったテープで固定します。 メスを使用して、断熱材に傷をつけ、断熱材が除去される端に印を付けます。 各ニックネームで、各ニックネームにメスの刃で一連の~6カットを行います:上部に~2、側面に~2、ワイヤーの下に~2。注意: ワイヤー自体を切断しすぎないようにすることが重要です。そうしないと、ストランドが壊れる可能性があります。ワイヤへの損傷を抑えながら絶縁体を完全に切断するための適切な圧力を得るには、練習が必要です。 電極ペアを180度回転させ、各ニックで6つのカットを繰り返します。 必要に応じて追加のカットを配置して、0.5mmの絶縁体を下にあるワイヤから分離します。ここで必要なカットの数は、加えられる圧力とメスの刃の切れ味によって異なります。 メスの刃を傾けて、緩んだ絶縁体に沿って縦に切断し、鉗子を使用してワイヤーから取り外します。 露出したワイヤーに、組織への挿入中に損傷を引き起こす可能性のある破損や擦り切れた絶縁体がないか検査します。 コネクタ端の各ワイヤの端から 1 mm をはがします。 挿入端の各ワイヤの端から5mm剥がします。 挿入端のワイヤセグメントをねじり合わせ、5mmの露出端を0.5インチのシャフトに圧着します。27Gの針。一般的な皮下注射針は、ルアーロックのエンディングを取り外した後に使用できます。 電極ペアごとに手順1.1〜1.6を繰り返します。 コネクタを組み立てます。12ピンコネクタのメス端( 材料の表を参照)をサイズに切り詰めます:#電極ペアx2ピンスロット。 各コネクタポートから真ちゅう製のフィッティング(これらは12ピンコネクタにあらかじめ取り付けられています)をペンチでそっと取り外します。これらのフィッティングは、次のステップのために保存します。 各ワイヤの露出した1mmの端を、真鍮製フィッティングのブレードの1つの外面にはんだ付けします。注意: はんだ付けすると、皮膚、目、呼吸器の炎症を引き起こす可能性のある煙が放出されます。手袋を着用し(または後で手を洗い)、目の保護具を使用し、地元の排煙装置を使用して曝露を制限します。真ちゅう製の金具を、補助ハンドツールに取り付けられた歯のないワニ口クリップに固定し、ブレードの1つの外面を上にして固定します。 フィッティングを顕微鏡下に配置して、はんだ付け中に高い視覚制御を可能にします。広げたペーパークリップまたは端線を使用して、ブレードの表面にステンレス鋼の適合フラックスを少量軽くたたきます。 幅の狭い円錐形のはんだチップを使用して、真鍮ブレードの下部~1.5mmを覆うのに十分なはんだをブレードに塗布します。注意: ここにはんだが多すぎるとコネクタの組み立てに干渉しますが、はんだが少なすぎると接続が不十分になる可能性があります。必要に応じて最初からやり直すために、追加の真鍮製フィッティングを用意してください。 ブレードのはんだの表面には、ステンレス製適合フラックスをたっぷりと塗布しますが、2枚のブレードの隙間にフラックスが垂れ落ちないようにしてください。 露出した1mmの電極線をブレードのはんだと同じ高さに保持し、はんだを鉄で加熱して接続を融合します。 接続を検査する:露出したワイヤの大部分はんだに沈め、ワイヤを真鍮製のフィッティングにしっかりと取り付ける必要があります。真鍮製フィッティングの2つのブレードの間にはんだが入っていないことを確認してください – これにより、後でオスコネクタを挿入するのが難しくなる可能性があります。最後に、接続が真鍮のブレードと同じ高さにあることを確認して、次のステップでフィッティングをコネクタに再挿入できるようにします。 まっすぐな鉗子を使用して、はんだ付けされた各真鍮フィッティングをコネクタに再度挿入し、各電極ペアのワイヤが互いに隣接し、他の電極ペアと絡まっていないことを確認します。 図1B を参照して、コネクタ内の1つの電極ペアの向きを視覚化します。注意: 左から右への理想的な向きは、上腕二頭筋 (コネクタ端で 3.5 mm)、上腕三頭筋 (コネクタ端で 3.5 mm)、橈側手根伸筋 (ECR、コネクタ端で 4.5 mm)、および長手掌筋 (PL、コネクタ端で 4.5 mm) です。片側をマーカーまたはホワイトアウトでマークして、埋め込み中のコネクタの向きを追跡します。 オス12ピンコネクタをメス端と同じサイズ(#電極ペア×2)に切り詰め、メスコネクタに接続します。継手がずれてしまった場合は、オスコネクタを装着した後、ストレート鉗子で再挿入することができます。 真鍮製の金具から発せられているタブをペンチで取り外します。 ピンスロットをエポキシでコーティングし、コネクタの近くにあるすべての金属またはワイヤが組織から絶縁されるようにします。注意: エポキシは、長時間の曝露により、皮膚、目、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。手袋を着用し、目の保護具を着用し、風通しの良い場所または局所的な排煙装置の下でのみエポキシを使用してください。 コネクタを少なくとも 30 分間風乾させます。 各電極ペアの抵抗をテストし、手術中に簡単に識別できるように、熱収縮の小さな色付きのセグメントで針にラベルを付けます。注:抵抗は18〜50オームである必要があります。抵抗が低い場合は、短絡を示している可能性があります。抵抗値が高い場合は、より線の損傷が大きすぎることを示している可能性があります。ただし、抵抗が高いのは、ニードルシャフトとワイヤ(ステップ1.6で作成)の間の接続が不完全であることに起因していることが多く、この接合部で追加の圧着を行うことで解決できます。 埋め込む前に、電極セットに繊維やその他の破片がないことを確認してください。これにはスプレーダスターを使用できます。顕微鏡で検査することは、検証に役立ちます。 2. 電極埋め込み手術 注:このセクションでは、前のセクションで製造したヘッドプレートと電極を上腕三頭筋、上腕二頭筋、橈側手根伸筋(ECR)、および長手掌筋(PL)に埋め込むための単一の外科的手順について説明します。後者の2つの筋肉の場合、近くの相乗筋を経由せずに、これらの個々の筋肉にのみ電極を埋め込むことは非常に困難です。個々の筋肉から記録を分離しようとする際の注意点については、以下の説明を参照してください。ヘッドプレートは通常、特定の実験のためにカスタム設計および製造されています。本研究では、3Dプリントされたプラスチックリベットヘッドプレート19を使用しました。多くのオープンソースのヘッドプレートデザインは、Janelia、Allen Institute、および独立した研究グループを通じてオンラインで入手できます。ここで説明するヘッドプレートの手順は、チタン製およびプラスチック製のヘッドプレートで成功裏に使用されています。外科的処置は、10〜40倍の倍率の実体顕微鏡を備えた脳定位固定装置( 材料の表を参照)で行う必要があります。 電極とヘッドプレートを1.5%グルタルアルデヒドを使用して一晩または8時間冷間滅菌します。滅菌水で短時間すすぎ、完全に風乾させてから移植します。注意: グルタルアルデヒドは飲み込むと有害であり、目、皮膚、気道に刺激を与える可能性があります。換気されたヒュームフードに手袋をはめたハンドル。 導入チャンバー内の医療グレードの酸素に 2-4% イソフルランを使用して麻酔を誘発し、施設で承認されたプロトコルに従って立ち直り反射が失われるまで (約 3 分)。 動物を可動式ノーズコーンに移し、麻酔を受け続けます。医療グレードの酸素に2%イソフルランを含ませた麻酔下で、手術前に動物の頭、首、手足を剃ります。このセクションの残りのすべての手順を麻酔下で実行します。必要に応じてイソフルランの投与量を調整して、呼吸数を1 Hzに保ち、つま先をつまむ反射がないようにします。. アイローションを塗布し、手術中は1時間ごとに再塗布します。 手術の開始時に、注射可能な鎮痛剤(カルプロフェン、5 mg / kgなど)と抗生物質薬(エンロフロキサシン、10 mg / kgなど)を皮下投与します( 材料の表を参照)。 次の手順または機関が承認した別の方法を使用してヘッドプレートを埋め込みます。動物の頭を定位固定装置のイヤーバーに固定し、固定装置に取り付けられた鼻円錐を通して麻酔(2%イソフルラン)を行います。無菌を維持するために滅菌ドレープを追加します。 ポビドンヨード調製パッドと滅菌アルコール調製パッドで頭と首を清掃します。必要に応じて、目の潤滑剤を再度塗布します。 リドカイン(4 mg / kg)( 材料の表を参照)を切開部位に皮下注射します。. つま先をつまむことにより、適切な麻酔薬の導入を確保します。直立反射がない場合は、動物の頭の正中線を目の尾側の端から耳の尾側の端まで切開します。 ティッシュクリップで皮膚を固定します:目のすぐ後ろの両側の吻側の端に2つ、耳のすぐ後ろの尾側の端に2つ。 メスの刃でやさしくこすり、乾燥した筋膜を取り除き、頭蓋骨の表面をきれいにします。 頭蓋骨の表面に歯科用セメントの薄層( 材料の表を参照)を塗布し、5分間乾燥させます。 ヘッドプレートを動物の頭蓋骨に置きます。ヘッドプレートを埋め込む方法と場所は、ヘッドプレートと研究課題によって異なります。 デンタルセメントを使用して、ヘッドプレートを頭蓋骨に接着します。頭蓋骨が完全に覆われていることを確認してください。歯科用セメントを10分間乾燥させます。 動物を可動式のプラスチック製ノーズコーンに移して、手術の残りの部分に麻酔を提供します。これにより、手術中に動物を定期的に再配置して、麻酔を維持しながらさまざまな筋肉にアクセスできるようになります。 首の後ろの切開部(ヘッドプレートの移植中に行われる)を伸ばして、耳の尾側1cmに達するようにします。 鈍骨スクレーパーを使用して、首の切開部の下の皮膚を下の組織から分離し、首の切開部から電極が埋め込まれる前肢までの経路を確保します。 EMGコネクタを小さなテープを使用してヘッドプレートに一時的に固定し、電極の埋め込み中に所定の位置に保持します。 ポビドンヨード調製パッドと滅菌アルコール調製パッドで動物の前肢を洗浄します。 上腕三頭筋を切開します。上腕三頭筋を上に向けて動物を横向きに置きます。 リドカイン(4 mg / kg)を予定された切開部位に注入します。.これにより、移植中に局所的な痛みが緩和され、筋肉が湿った状態に保たれます。注:筋肉は湿ったままで、手術中は濡れないようにする必要があります。筋肉や皮膚が乾燥しているように見える場合は、必要に応じて滅菌生理食塩水を局所的に塗布します。. 骨と平行な上腕三頭筋の7mmを切ります。 切開部の周囲の皮膚を、鈍い骨スクレーパーで下層組織から分離します。スクレーパーを皮膚の下から首の切開部まで動かして、電極の経路をクリアします。 筋肉を覆い隠している筋膜を切り取ります。 上腕三頭筋の切開部に閉じたハサミを挿入し、穴を出た後に少し開いて首の穴を押し出すことにより、首から上腕三頭筋への経路が十分に大きいことを確認します。 上腕三頭筋の電極を上腕三頭筋の切開部に持っていきます:大きなニードルドライバーの先端を上腕三頭筋の切開部から挿入し、首の切開部から取り出します。ニードルドライバーを電極針の周りに縦にクランプし、上腕三頭筋の切開部まで引き抜きます。 上腕三頭筋の挿入:ステップ3「筋肉への電極の挿入」に従います。 遠位腕を切開します。動物を仰向けにします。 手のひらを下に向けて、腕を動物の側面に沿ってテープで固定します。 リドカイン(4 mg / kg)を予定された切開部位に注入します。. 上腕二頭筋とECRの上に1cmの切開を行い、三角筋の下部から下腕の中央まで、骨と平行に切り込みます。切開部の遠位端は、下腕の筋肉の端から~2mm上にある必要があります。 筋膜をきれいにして、上腕二頭筋を露出させます。 遠位腕の切開部から上腕三頭筋の切開部に戻る経路を、上腕の皮膚の下に沿って走る大きな血管の上(近位)に戻します。 上腕二頭筋の電極を皮膚の下に通し、首の切開から上腕三頭筋の切開まで、次に上腕三頭筋の切開から遠位腕の切開まで通します。 上腕二頭筋の挿入:ステップ3「筋肉への電極の挿入」に従います。動物の腕を同じ位置にテープを貼り直しますが、手のひらを下に向けています。 露出した上腕二頭筋の近位端にできるだけ近づけて挿入します。 電極の少なくとも3 mmを筋肉組織に沈めるには、マウスのサイズに応じて、筋線維に対してわずかに斜めに挿入してください。 上腕三頭筋の切開部から、上腕の皮膚の下を通る大きな血管の下(遠位)の遠位腕挿入部位までの経路をクリアし、上腕二頭筋電極の経路とは異なる経路を作成します。 ECR挿入:ステップ3「筋肉への電極の挿入」に従います。ECRの最も近位の部分に挿入します。 ECRとその拮抗薬との間の折り目から出て、この折り目で結び目を作ります。 上腕三頭筋の挿入から肘の下のPL挿入部位までの経路をクリアします。 PL挿入:ステップ3「筋肉への電極の挿入」に従います。動物を仰向けに置き、手のひらを上にして腕を頭にテープで固定します。 肘のちょうど遠位に挿入します。 手首の腱に十分に近位に出て、出口部位の結び目が手首の腱ではなく筋肉にくるようにします。 動物を横向きに再配置し、6-0シルク縫合糸を使用して上腕三頭筋の切開部を縫合します。 動物を仰向けに再配置し、6-0シルク縫合糸を使用して遠位腕の切開部を縫合します。 ヘッドプレートの背面にデンタルセメントを使用してコネクタを固定します。 6-0シルク縫合糸を使用して首の切開を縫合します。 炎症を軽減するために、切開部位に局所抗生物質クリームを塗布します。 エリザベス朝の首輪( 材料の表を参照)を動物に取り付けて、回復中に縫合糸を邪魔しないようにします。 3. 筋肉に電極を挿入する 曲げて針をわずかに曲げます(27 G、ステップ1)。ニードルドライバー( 材料の表を参照)で針を持ち、一対の鉗子のハンドルに押し付けて、5〜10度の曲げを追加します。 針の長さに沿って異なる位置に合計3つのベンドを追加します。 筋肉の出入り位置を視覚化します。 入口と出口の部位を覆い隠している脂肪や筋膜を、細い鉗子で切断または引っ張って取り除きます。出血を制限するために、血管の損傷を避けるようにしてください。 筋繊維と平行に走る3〜5mmの水中ワイヤーを目指します。これにより、露出した電極ワイヤーのストレッチが筋肉内に沈むようになります。 ニードルドライバーを使用して、もう一方の手で鈍い湾曲した鉗子で逆圧をかけながら、筋肉の近位端に針を挿入します。針を筋肉に通して出口部位まで押し込みます。 針が筋肉から出たら、鈍い鉗子で先端をつかみ、針を引き抜きます。近位の結び目が挿入部位の上に座るまで引っ張り続けます。 遠位結び目を作ります。鉗子を使用して、出口部位の遠位に緩い結び目を結びます。結び目を1cmのループに締めます。 鉗子でループを押し、出口部位の上に配置します。 遠位結び目を完全に締める前に、出口部位から約0.5mm遠位のどこまで閉じるべきかを視覚化します。この位置で細かく曲がった鉗子でループをそっとつかみ、ループを鉗子の上にしっかりと引っ張ります。注:このステップでは、出口部位のすぐ上で遠位結び目を締めないでください、または次のステップで結び目が完全に締められると筋肉が圧迫されます。 結び目から細い鉗子を取り外し、細い曲げた鉗子で結び目を出口部位に向かって押し、針の端を指で引っ張って結び目を締めます。近位と遠位の両方の結び目がそれぞれ挿入部位と出口部位の外側に適切に配置されていることを確認して、挿入された電極を所定の位置に固定します。 出口の結び目をまっすぐで細い鉗子でつかみ、鉗子の周りの遠位ワイヤーをしっかりとカールさせて、結び目の周りのワイヤーを筋肉に向かって/皮膚から離します。 遠位結び目から0.5mm遠位のワイヤーを切り取り、結び目の周りに小さなこぶを巻き付けたままにします。前のステップでは、こぶの切り口が動物の皮膚に突き刺さず、炎症を引き起こすことがないようにします。 4. 術後のケア 手術直後は、以下の手順で行ってください。ケージの仲間が縫合糸を邪魔しないように、動物を一人で飼います。 動物を低い寝具のある清潔なケージに入れます。エリザベス朝の首輪を着用している間、動物の可動性を妨げる可能性のあるネストレットとエンリッチメントマテリアルをすべて取り除きます。 首輪を着用したままアクセスできる水とウェットフードを動物に与えます。 手術後24時間および48時間後に次の手順を実行します。エリザベス朝の首輪を取り外して、動物が20分間自分で毛づくろいをできるようにします。 ステップ2.2およびステップ2.3で述べたように、イソフルランで麻酔を誘発します。 注射可能な鎮痛薬と抗生物質の薬を投与します。 切開部位に縫合糸の欠落、開放創、感染や炎症の兆候がないか検査します。縫合糸を交換し、必要に応じてより多くの局所抗生物質を塗布します。 エリザベス朝の首輪が外されるまで、48時間ごとにウェットフードを交換してください。 手術後6日で以下の手順を行ってください。傷が完全に治癒することを確認してください。 傷口が閉じている場合は、縫合糸を抜いてください。傷口が開いている場合は、縫合糸を取り除くためにさらに2日待ちます。縫合糸を抜くときは、エリザベス朝の首輪を外します。 マウスを新しい清潔なケージに戻し、完全な寝具と濃縮物を提供します。注:動物は手術後7日で実験または水分不足に進むことができます。