בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.
Abstract
התגובה החיסונית הנרכשת מסתמכת על יכולתו של תא T לנדוד דרך דם, לימפה ורקמות בתגובה לפתוגנים ולגופים זרים. נדידת תאי T היא תהליך מורכב הדורש תיאום של קלטי אותות רבים מהסביבה ומתאי מערכת החיסון המקומית, כולל כימוקינים, קולטני כימוקין ומולקולות הידבקות. יתר על כן, תנועתיות תאי T מושפעת מרמזים סביבתיים דינמיים, שיכולים לשנות את מצב ההפעלה, נוף השעתוק, ביטוי מולקולות ההיצמדות ועוד. In vivo, המורכבות של גורמים אלה השלובים לכאורה זה בזה מקשה להבחין באותות בודדים התורמים לנדידת תאי T. פרוטוקול זה מספק שורה של שיטות מבידוד תאי T ועד ניתוח בעזרת מחשב כדי להעריך נדידת תאי T בזמן אמת בתנאים סביבתיים ספציפיים ביותר. תנאים אלה עשויים לעזור להבהיר מנגנונים המווסתים את הנדידה, לשפר את הבנתנו את הקינטיקה של תאי T ולספק ראיות מכניסטיות חזקות שקשה להשיג באמצעות ניסויים בבעלי חיים. הבנה עמוקה יותר של האינטראקציות המולקולריות המשפיעות על נדידת תאים חשובה לפיתוח טיפולים משופרים.
Introduction
תאי T הם הגורמים העיקריים לתגובה חיסונית נרכשת, ספציפית לאנטיגן. ברמת האוכלוסייה, תאי T הם הטרוגניים, המורכבים מתת-קבוצות תאיות בעלות פונקציות מיוחדות שונות. חשוב לציין, תאי CD8+ T הם המשפיעים הציטוליטיים העיקריים של המערכת החיסונית, אשר מבטלים ישירות תאים נגועים או לא מתפקדים1.
תאי T בוגרים מסוג CD8+ שוכנים ברקמה וזורמים דרך הדם והלימפה בחיפוש אחר אנטיגנים. במהלך ההדבקה, תאי T מוצגים עם אנטיגנים בדם או ברקמה ומתנקזים במהירות לטחול או לבלוטת הלימפה המתנקזת הקרובה ביותר כדי להתחיל תגובה חיסונית פרודוקטיבית. בכל מקרה, תאי T מופעלים, עוברים הרחבה שבטית ועוזבים את מערכת הלימפה כדי להיכנס לדם, אם עדיין לא שם. במהלך תהליך זה, איתות תוך-תאי מעניק את הירידה בוויסות של קולטני הביות הלימפטיים ואת ה-upregulation של קולטני אינטגרין וכימוקין רבים החיוניים לנדידה ספציפית לרקמה2. בסופו של דבר, ההגירה המכוונת של תאי T לאתרי זיהום מונעת על ידי אותות סביבתיים מתכנסים הכוללים איתות אינטגרין וכימוקין.
ניתן לסווג כימוקינים באופן כללי לשני סוגים עיקריים: (1) אותות הומיאוסטטים, החיוניים להתמיינות, הישרדות ותפקוד בסיסי, ו-(2) אותות דלקתיים, כגון CXCL9, CXCL10 ו-CCL3, הנדרשים לכימוטקסיס. באופן כללי, כימוקינים יוצרים שיפוע אות המניע נדידה כיוונית, המכונה כימוטקסיס, בנוסף להפעלת ביטוי אינטגרין1. כימוטקסיס מווסתת היטב ורגישה מאוד, עם תאי T המסוגלים להגיב לשינויים זעירים בשיפוע שיכולים להוביל אותם לכיוון או מיקום מסוים.
בנוסף לגורמים אלה הקשורים לתאי T, ההגירה מושפעת גם מההרכב והצפיפות של המטריצה החוץ תאית (ECM). ה-ECM מורכב מרשת צפופה של חלבונים, כולל קולגן ופרוטאוגליקנים, המספקים את הפיגום לקולטני אינטגרין דביקים על תאי T. אינטגרינים הם משפחה מגוונת של חלבונים טרנסממברנליים, שלכל אחד מהם תחומי קישור מיוחדים מאוד והשפעות איתות במורד הזרם. ביטוי דינמי של קולטני אינטגרין על פני תא T מאפשר הסתגלות מהירה לסביבתם המשתנה3. חשוב לציין, אינטגרינים מחברים את רשתות האקטין ECM והאקטין הציטו-שלד התוך-תאי שפועלות יחד כדי ליצור את כוח ההנעה הדרוש לתנועת תאי T.
לסיכום, דפוסי ההגירה משתנים בהתאם לפנוטיפ של תא החיסון או לאותות סביבתיים. תהליכים ביולוגיים מורכבים אלה מווסתים היטב על ידי ביטוי של ציטוקינים, כימוקינים ואינטגרינים על פני השטח של תא T, התאים הסובבים אותו, והרקמה המקומית הנגועה. In vivo, מנגנוני נדידה אלה יכולים להיות מורכבים ועשויים לנבוע ממספר אותות מוספים4. בשל מורכבות זו, זה יכול להיות בלתי אפשרי לקבוע קשר סיבתי בין משתנים שלובים לכאורה. כדי להתגבר על כך, ישנן מספר גישות במבחנה לחקר היבטים ספציפיים של נדידת תאי T כגון תגובה לאותות כימוקינים ספציפיים והאינטראקציה בין אינטגרינים של תאי T וחלבונים קושרי ECM. פרוטוקול זה מטפל בשיטות לבידוד והפעלה של תאי T מסוג +CD8, עם מבחני נדידת מבחנה במרחב דו-ממדי וכלי ניתוח חישוביים לניתוח נדידת תאי T שצוינו. שיטות אלה מועילות למשתמש מכיוון שהן אינן דורשות חומרים או התקנים מתוחכמים, כמו בכמה מבחני נדידת תאים אחרים המתוארים בספרות. נתוני נדידת תאים הנוצרים בשיטות אלה יכולים לספק ראיות לתגובות חיסוניות באופן פשטני המאפשר חקירה נוספת ומושכלת in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבנת ההשפעה הביולוגית של התכנסות אותות in vivo היא מאתגרת ולא קלה לפרשנות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מספקים שיטה סבירה להבנת נדידת תאי T בתנאים מוגדרים מאוד ורלוונטיים ביולוגית. תנאים אלה יכולים להיות מוגדרים על פי שיקול דעתו של החוקר, וניתן לשנות את הפרוטוקולים כך שיתאימו לצרכים של אוכלו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברים קודמים ונוכחיים במעבדת קים שתרמו לפיתוח פרוטוקולים אלה לאורך זמן. הנתונים המייצגים התאפשרו על ידי P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States ו-P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States. פרסום זה התאפשר בחלקו הודות למענק מספר T32 GM135134 מטעם פרס שירות המחקר הלאומי ע”ש רות ל. קירששטיין.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
