Summary

13名LC-MSに関連するC6-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

Published: March 22, 2024
doi:

Summary

液体クロマトグラフィー高分解能質量分析と組み合わせた 13C6-グルコース標識の開発された方法は汎用性が高く、薬用植物における二次代謝産物の合成に関与する主要な臓器と経路、およびこれらの二次代謝産物の包括的な利用に関する将来の研究の基礎を築きます。

Abstract

この論文は、二次代謝物合成に関与する一次臓器を認証するための新しく効率的な方法を提示します。Parispolyphylla var. yunnanensis(Franch.)の最も重要な二次代謝物として手。-Mzt.(PPY)、パリサポニン(PS)はさまざまな薬理活性を持ち、PPYの需要が高まっています。この研究では、葉、根茎、および幹-血管束 13C6-グルコース摂食および非摂食の 4 つの治療法を確立し、パリサポニン VII (PS VII) 合成に関与する主要な臓器を正確に認定しました。液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を組み合わせることにより、さまざまな処理における葉、根茎、茎、根の13C/12C比を迅速かつ正確に計算し、(M+1)/M、(M+2)/M、(M+3)/M、(M+4)/Mの4種類のPS同位体イオンピーク(M-)比を見つけました。その結果、茎-血管束と根茎の摂食処理の根茎の13C/12Cの比率は、非摂食治療のそれよりも有意に高いことが示されました。非摂食処理と比較して、葉中のPS VII分子(M + 2)/ M-の比率は、葉および茎-血管束の供給処理の下で有意に増加しました。同時に、非摂食処理と比較して、根茎処理中の葉のPS VII分子(M + 2)/ Mの比率は有意差を示さなかった。さらに、茎、根、根茎のPS VII分子(M + 2)/Mの比率は、4つの処理間で差を示さなかった。非摂食処理と比較して、葉の供給処理を受けた葉のパリサポニンII(PS II)分子(M+2)/Mの比率は有意差を示さず、PS II分子のPS II分子の(M+3)/Mの比率は低かった。このデータにより、PS VIIの合成の主要な器官は葉であることが確認されました。これは、薬用植物における二次代謝産物の合成に関与する主要な器官と経路の将来の同定の基礎を築きます。

Introduction

植物における二次代謝産物の生合成経路は複雑で多様であり、非常に特異的で多様な蓄積器官が関与しています1。現在、多くの薬用植物における二次代謝産物の特異的な合成部位と責任のある器官は明確に定義されていません。この曖昧さは、医薬品の収量と品質の両方を最適化するように設計された栽培方法の戦略的な進歩と実施に大きな障害をもたらします。

分子生物学、生化学的、および同位体標識技術は、薬用植物2,3,4,5の二次代謝産物の合成経路と部位を解明するために広く採用されており、これらの方法論のそれぞれは、効率や精度の違いなど、独自の長所と限界を示しています。例えば、分子生物学的アプローチは、生合成経路内の部位を高い精度で特定することができますが、特に時間がかかります。その有用性は、一般に利用可能なゲノム配列を持たない種にとってさらに制約され、これらの技術はそのような場合には実行可能性が低くなる6。対照的に、3C/12C、2H/1H、および18O/16Oのような同位体比を用いた同位体標識技術は、二次代謝産物の合成、輸送、および貯蔵メカニズムを調査するための迅速でアクセス可能な手段を提供する7,8。それらは、葉中の有機化合物と安定同位体の空間分布を明らかにすることができ、それによって葉がライフサイクル9を通じて経験する環境条件の再構築を可能にします。さらに、13C6-グルコース1013C6-フェニルアラニン11などの外部同位体標識の適用により、炭素標識二次代謝産物の生成が可能になり、その産生と機能についての理解が深まります。

従来の炭素同位体標識技術は、その生合成経路と輸送メカニズムの種特異的な性質により、二次代謝産物の合成に関与する特定の器官を特定するという課題に直面しています。液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)は、この分野で極めて重要な分析装置として注目を集めており、薬物の化学合成における外因性同位体を追跡し、吸収、分布、代謝、排泄などのin vivoプロセスを調査するための堅牢な方法を提供しています12。LC-MSの優れた感度、率直性、信頼性は、プラント13における二次代謝産物の産生をモニタリングするための理想的な選択肢となっています。近年、LC-MSは、異なるサンプル間での標識効率の評価を可能にする外部同位体標識技術への応用でますます好まれるようになっています。この方法論は、薬用植物における二次代謝産物の合成に関与する主要な器官に関する重要な洞察を提供し、これらの化合物の合成器官を同定するための生物学的方法14,15を非常に補完する役割を果たします。したがって、このアプローチは、さまざまな標本間の標識効率の比較を容易にするだけでなく、植物の二次代謝産物の生成に関与する主要な器官に光を当て、それによってそれらの生合成の理解を深めます。

私たちは、炭素同位体標識とLC-MS検出を組み合わせて、薬用植物の二次代謝産物の合成に関与する主要な器官を特定する新しい方法を導入しました。パリサポニン(PS)は、抗がん作用、免疫調節作用、抗炎症作用など様々な薬理作用を有し16、PPYの需要は高まっている17。そこで、PPY苗を研究対象とし、LC-MS法に伴う13C6-Glucose標識を用いて、葉がパリサポニンVII(PS VII)(図1B)を合成する主要な器官であることを解読しました。私たちのアプローチには、葉、根茎、および茎-血管束への13C6-グルコースの供給と、非摂食制御を含む4つの異なる治療が含まれていました。13C6-グルコースの選択は、呼吸を介して迅速にアセチル補酵素Aに代謝され、PS合成を促進するため、戦略的です。13Cの自然の存在量を利用して、Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer(GC-IRMS)システムを利用して、さまざまな植物器官にわたる13C/12C比を評価し、PS VIIおよびParis saponins II(PS II)(図1B)分子の同位体イオンピーク比を分析しました。当社の方法論は、13種類のC標識植物二次代謝物前駆体と最先端の質量分析技術を活用しており、従来の炭素同位体標識法に代わる、よりシンプルで正確な方法を提供します。この新しいアプローチは、薬用植物の二次代謝産物合成に関与する器官の理解を深めるだけでなく、これらの化合物の生合成経路を将来探求するための強固な基盤を築くものです。

Protocol

1. 実験の準備 植物の成長中、温室の相対湿度が75%、昼/夜の温度が20°C / 10°C、日長が昼12時間と夜12時間で構成され、光強度が100μmol・m-2・s-1であることを確認してください。発光ダイオード(LED)ランプを介して放射照度を提供し、LEDランプと植物のキャノピーとの間に30cmの距離を保ちます。注:日長と光の強度は、雲南省の成長期間中の日照時間数によ?…

Representative Results

根茎への 13C6-グルコース供給が成功したことを確認するために、根茎における 13C/12C同位体比をさらに分析しました。処理3および4の 13C / 12C同位体比は、処理2の同位体比よりもはるかに高かった(図1A)。その結果、治療3および4の 13C6-グルコースが摂取により根茎に侵入したことが示されました。 <p clas…

Discussion

このプロトコルを成功裏に実施できるかどうかは、植物の生理学的特性、組織、器官、および二次代謝産物に関する包括的な研究にかかっています。このプロトコルで概説されている実験デザインアプローチは、植物の二次代謝産物の生合成経路を調査するための強固な基盤を築きます。この実験で重要なのは、(1)多年生の苗の年齢を決定すること、(2)正しい同位体標識検出タイミングを選?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学基金会の青少年プログラム(第82304670号)の資金提供を受けました。

Materials

0.1 % Formic acid water Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
13C6-Glucose powder MERCK 110187-42-3
Acetonitrile Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
AUTOSAMPLER VIALS Biosharp Biotechnology Company 44866
BEH C18 column Waters,Milfor,MA 1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software Thermo Scientific, Fremont,CA 3
Compound DiscovererTM  software  Thermo Scientific,Fremont,CA 3
Electric constant temperature blast drying oven DHG-9146A
Electronic analytical balance Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd SOP
Ethanol  Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44955
Fully automatic sample rapid grinder Shanghai Jingxin Technology Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer Thermo Fisher Delta V Advantage
Hoagland solution Sigma-Aldrich H2295-1L
Hydroponic tank JRD 1020421
Isodat software Thermo Fisher Scientific 3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry Agilent Technology  Agilent 1260 -6120 
Nitrogen manufacturing instrument PEAK SCIENTIFIC Genius SQ 24
Organic phase filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd 44890
Oxygen pump Magic Dragon MFL
Quantum sensor Highpoint UPRtek
Scalpel Handskit 11-23
Sprinkling can CHUSHI WJ-001
Xcalibur  software Thermo Fisher Scientific 4.2

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Chen, S., Chang, F., Lin, L., Wang, Y., Wen, F., Zhou, T., Pei, J. 13C6-Glucose Labeling Associated with LC-MS: Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis. J. Vis. Exp. (205), e66578, doi:10.3791/66578 (2024).

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