Summary

13Marcatura del C6-glucosio associata a LC-MS: identificazione degli organi primari delle piante nella sintesi di metaboliti secondari

Published: March 22, 2024
doi:

Summary

Il metodo sviluppato della marcatura del 13C6-glucosio combinato con la cromatografia liquida e la spettrometria di massa ad alta risoluzione è versatile e pone le basi per studi futuri sugli organi primari e sui percorsi coinvolti nella sintesi di metaboliti secondari nelle piante medicinali, nonché sull’utilizzo completo di questi metaboliti secondari.

Abstract

Questo articolo presenta un metodo nuovo ed efficiente per certificare gli organi primari coinvolti nella sintesi dei metaboliti secondari. Come il più importante metabolita secondario in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt. (PPY), la saponina di Parigi (PS) ha una varietà di attività farmacologiche e la PPY è sempre più richiesta. Questo studio ha stabilito quattro trattamenti per certificare con precisione gli organi primari coinvolti nella sintesi delle saponine di Parigi VII (PS VII). Combinando cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), i rapporti 13C/12C di foglia, rizoma, fusto e radice in diversi trattamenti sono stati calcolati in modo rapido e accurato e sono stati trovati quattro tipi di rapporti di picco ionico isotopico PS (M): (M+1) /M, (M+2) /M, (M+3) /M e (M+4) /M. I risultati hanno mostrato che il rapporto di 13C/12C nei rizomi dei trattamenti di alimentazione staminale-vascolare e rizoma era significativamente più alto di quello del trattamento non alimentare. Rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) /M nelle foglie è aumentato significativamente durante i trattamenti di alimentazione fogliare e stelo vascolare. Contemporaneamente, rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) /M nelle foglie sottoposte a trattamento con rizoma non ha mostrato differenze significative. Inoltre, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) /M nel fusto, nella radice e nel rizoma non ha mostrato differenze tra i quattro trattamenti. Rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra la molecola di saponina Paris II (PS II) (M+2) /M nelle foglie sottoposte a trattamento di alimentazione fogliare non ha mostrato differenze significative e il rapporto (M+3) /M delle molecole di PS II nelle foglie sottoposte a trattamento di alimentazione fogliare era inferiore. I dati hanno confermato che l’organo primario per la sintesi di PS VII sono le foglie. Getta le basi per la futura identificazione degli organi primari e delle vie coinvolte nella sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali.

Introduction

Le vie biosintetiche dei metaboliti secondari nelle piante sono intricate e diversificate e coinvolgono organi di accumulo altamente specifici e diversificati1. Attualmente, i siti di sintesi specifici e gli organi responsabili dei metaboliti secondari in molte piante medicinali non sono ben definiti. Questa ambiguità pone un ostacolo significativo all’avanzamento strategico e all’attuazione di metodi di coltivazione progettati per ottimizzare sia la resa che la qualità dei materiali medicinali.

La biologia molecolare, la biochimica e le tecniche di marcatura isotopica sono ampiamente impiegate per svelare le vie di sintesi e i siti dei metaboliti secondari nelle piante medicinali 2,3,4,5 e ciascuna di queste metodologie presenta punti di forza e limiti unici, come le differenze di efficienza e precisione. Gli approcci di biologia molecolare, ad esempio, offrono un’elevata precisione nell’individuare i siti all’interno dei percorsi biosintetici, ma richiedono molto tempo. La loro utilità è ulteriormente limitata per le specie prive di sequenze genomiche disponibili pubblicamente, rendendo queste tecniche meno praticabili per tali casi6. Al contrario, le tecniche di marcatura isotopica, che impiegano rapporti isotopici come 3C/12C, 2H/1H e 18O/16O, forniscono un mezzo rapido e accessibile per studiare la sintesi, il trasporto e i meccanismi di stoccaggio dei metaboliti secondari 7,8. Possono rivelare la distribuzione spaziale dei composti organici e degli isotopi stabili nelle foglie, consentendo così la ricostruzione delle condizioni ambientali vissute dalle foglie durante il loro ciclo di vita9. Inoltre, l’applicazione di marcature isotopiche esterne, come 13C6-Glucosio 10 e 13C 6-Fenilalanina11, consente la generazione di metaboliti secondari marcati con carbonio, migliorando la nostra comprensione della loro produzione e funzione.

Le tecniche tradizionali di marcatura degli isotopi di carbonio incontrano sfide nell’individuare gli organi specifici responsabili della sintesi dei metaboliti secondari a causa della natura altamente specie-specifica delle loro vie biosintetiche e dei meccanismi di trasporto. La cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) è diventata uno strumento analitico fondamentale in questo settore, offrendo un metodo robusto per tracciare gli isotopi esogeni nella sintesi chimica di farmaci e studiare processi in vivo come l’assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l’escrezione12. La sensibilità, la semplicità e l’affidabilità superiori della LC-MS la rendono la scelta ideale per il monitoraggio della produzione di metaboliti secondari nelle piante13. Negli ultimi tempi, la LC-MS è diventata sempre più apprezzata per la sua applicazione nelle tecniche di marcatura isotopica esterna, che consente di valutare l’efficienza della marcatura su diversi campioni. Questa metodologia fornisce informazioni critiche sugli organi primari coinvolti nella sintesi di metaboliti secondari nelle piante medicinali, fungendo da prezioso complemento ai metodi biologici per identificare gli organi di sintesi di questi composti14,15. Di conseguenza, questo approccio non solo facilita il confronto delle efficienze di marcatura tra i vari campioni, ma fa anche luce sugli organi chiave implicati nella generazione di metaboliti secondari delle piante, migliorando così la nostra comprensione della loro biosintesi.

Abbiamo introdotto un nuovo metodo che combina la marcatura degli isotopi di carbonio con il rilevamento LC-MS per identificare gli organi primari responsabili della sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali. La saponina di Parigi (PS) ha una varietà di attività farmacologiche come l’antitumorale, l’immunomodulazione e l’antinfiammatorio16 e la PPY è sempre più richiesta17. Pertanto, abbiamo utilizzato piantine di PPY come soggetti di ricerca e abbiamo decifrato che le foglie sono l’organo principale per sintetizzare la saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) utilizzando la marcatura 13C6-Glucosio associata al metodo LC-MS. Il nostro approccio includeva quattro diversi trattamenti che prevedevano l’alimentazione di 13C6-glucosio su foglie, rizoma e fasci staminali-vascolari, nonché un controllo di non alimentazione. La scelta del 13C6-glucosio è strategica, in quanto viene rapidamente metabolizzato in acetil coenzima A attraverso la respirazione, che poi facilita la sintesi del PS. Utilizzando l’abbondanza naturale di 13C, abbiamo utilizzato un sistema di spettrometro di massa con rapporto isotopico stabile per gascromatografia (GC-IRMS) per valutare i rapporti 13C/12C in vari organi della pianta e per analizzare i rapporti di picco degli ioni isotopici nelle molecole PS VII e Paris saponine II (PS II) (Figura 1B). La nostra metodologia, che sfrutta 13precursori di metaboliti secondari di piante marcati con C e tecniche di spettrometria di massa all’avanguardia, offre un’alternativa più semplice e accurata ai metodi convenzionali di etichettatura degli isotopi di carbonio. Questo nuovo approccio non solo approfondisce la nostra comprensione degli organi coinvolti nella sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali, ma getta anche solide basi per future esplorazioni sui percorsi biosintetici di questi composti.

Protocol

1. Preparazione sperimentale Assicurati che durante la crescita delle piante, l’umidità relativa della serra sia del 75%, le temperature giorno/notte siano di 20 °C/10 °C, il fotoperiodo sia composto da 12 ore di giorno e 12 ore di notte e l’intensità della luce sia di 100 μmol·m-2·s-1. Fornire irraggiamento tramite lampade a diodi emettitori di luce (LED), mantenendo una distanza di 30 cm tra la lampada a LED e la chioma della pianta.NOTA: Il fotoperiodo e l’in…

Representative Results

Per confermare che l’apporto di 13C6-glucosio nei rizomi ha avuto successo, abbiamo ulteriormente analizzato i rapporti isotopici 13C/12C nei rizomi. I rapporti isotopici 13C/12C dei trattamenti 3 e 4 erano molto più alti di quelli del trattamento 2 (Figura 1A). I risultati hanno indicato che 13C6-glucosio dei trattamenti 3 e 4 sono entrati nei rizomi attraverso l’ingestione. …

Discussion

Il successo dell’implementazione di questo protocollo si basa su una ricerca completa sulle proprietà fisiologiche delle piante, sui tessuti, sugli organi e sui metaboliti secondari. L’approccio di progettazione sperimentale delineato nel protocollo getta solide basi per lo studio delle vie biosintetiche dei metaboliti secondari delle piante. I fattori critici in questo esperimento sono (1) determinare l’età delle piantine perenni e (2) scegliere il corretto momento di marcatura-rilevamento degli isotopi. Le piante med…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China’s Youth Program (n. 82304670).

Materials

0.1 % Formic acid water Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
13C6-Glucose powder MERCK 110187-42-3
Acetonitrile Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
AUTOSAMPLER VIALS Biosharp Biotechnology Company 44866
BEH C18 column Waters,Milfor,MA 1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software Thermo Scientific, Fremont,CA 3
Compound DiscovererTM  software  Thermo Scientific,Fremont,CA 3
Electric constant temperature blast drying oven DHG-9146A
Electronic analytical balance Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd SOP
Ethanol  Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44955
Fully automatic sample rapid grinder Shanghai Jingxin Technology Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer Thermo Fisher Delta V Advantage
Hoagland solution Sigma-Aldrich H2295-1L
Hydroponic tank JRD 1020421
Isodat software Thermo Fisher Scientific 3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry Agilent Technology  Agilent 1260 -6120 
Nitrogen manufacturing instrument PEAK SCIENTIFIC Genius SQ 24
Organic phase filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd 44890
Oxygen pump Magic Dragon MFL
Quantum sensor Highpoint UPRtek
Scalpel Handskit 11-23
Sprinkling can CHUSHI WJ-001
Xcalibur  software Thermo Fisher Scientific 4.2

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Chen, S., Chang, F., Lin, L., Wang, Y., Wen, F., Zhou, T., Pei, J. 13C6-Glucose Labeling Associated with LC-MS: Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis. J. Vis. Exp. (205), e66578, doi:10.3791/66578 (2024).

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