Summary

13C 6-Glukosemarkierung im Zusammenhang mit LC-MS: Identifizierung pflanzlicher Primärorgane bei der Synthese von Sekundärmetaboliten

Published: March 22, 2024
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Summary

Die entwickelte Methode der 13C 6-Glukose-Markierung in Kombination mit der Flüssigchromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie ist vielseitig einsetzbar und legt den Grundstein für zukünftige Studien zu den primären Organen und Signalwegen, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind, sowie für die umfassende Nutzung dieser Sekundärmetaboliten.

Abstract

In dieser Arbeit wird eine neuartige und effiziente Methode zur Zertifizierung von Primärorganen vorgestellt, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind. Als wichtigster Sekundärmetabolit in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Pariser Saponin (PS) hat eine Vielzahl von pharmakologischen Aktivitäten und PPY erfreut sich einer zunehmenden Nachfrage. In dieser Studie wurden vier Behandlungen, die Blatt-, Rhizom- und Stamm-Gefäß-Bündel 13C6-Glukose füttern und nicht füttern, etabliert, um die primären Organe, die an der Synthese von Pariser Saponinen VII (PS VII) beteiligt sind, genau zu zertifizieren. Durch die Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) wurden die 13C/12C-Verhältnisse von Blatt, Rhizom, Stamm und Wurzel in verschiedenen Behandlungen schnell und genau berechnet, und es wurden vier Arten von PS-Isotopen-Ionen-Peak(M-)-Verhältnissen gefunden: (M+1) /M-, (M+2) /M, (M+3) /M und (M+4) /M. Die Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis von 13C/12C in den Rhizomen der Stamm-Gefäßbündel- und Rhizom-Fütterungsbehandlungen signifikant höher war als in der nicht-fütternden Behandlung. Im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung stieg das Verhältnis von PS VII-Molekülen (M+2) /M in den Blättern unter der Fütterung von Blättern und Stängel-Gefäßbündeln signifikant an. Gleichzeitig zeigte das Verhältnis der PS VII-Moleküle (M+2) /M in den Blättern unter Rhizombehandlung im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung keinen signifikanten Unterschied. Darüber hinaus zeigte das Verhältnis der PS VII-Moleküle (M+2) /M im Stamm, der Wurzel und dem Rhizom keine Unterschiede zwischen den vier Behandlungen. Im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung zeigte das Verhältnis des Pariser Saponin II (PS II)-Moleküls (M+2) /M in den Blättern unter der Blattfütterung keinen signifikanten Unterschied, und das (M+3) /M−-Verhältnis der PS-II-Moleküle in den Blättern unter der Blattfütterung war niedriger. Die Daten bestätigten, dass das primäre Organ für die Synthese von PS VII die Blätter sind. Es legt den Grundstein für die zukünftige Identifizierung der primären Organe und Signalwege, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind.

Introduction

Die Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten in Pflanzen sind kompliziert und vielfältig und umfassen hochspezifische und vielfältige Akkumulationsorgane1. Gegenwärtig sind die spezifischen Synthesestellen und verantwortlichen Organe für Sekundärmetaboliten in vielen Heilpflanzen nicht genau definiert. Diese Unklarheit stellt ein erhebliches Hindernis für die strategische Weiterentwicklung und Umsetzung von Anbaumethoden dar, die sowohl die Ausbeute als auch die Qualität von Arzneimitteln optimieren sollen.

Molekularbiologische, biochemische und Isotopenmarkierungstechniken werden ausgiebig eingesetzt, um die Synthesewege und -stellen von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzenzu entschlüsseln 2,3,4,5, und jede dieser Methoden weist einzigartige Stärken und Grenzen auf, wie z. B. Unterschiede in der Effizienz und Genauigkeit. Molekularbiologische Ansätze bieten beispielsweise eine hohe Präzision bei der Lokalisierung der Stellen innerhalb der Biosynthesewege, sind aber besonders zeitintensiv. Ihr Nutzen ist für Arten ohne öffentlich zugängliche Genomsequenzen weiter eingeschränkt, so dass diese Techniken in solchen Fällen weniger brauchbar sind6. Im Gegensatz dazu bieten Isotopenmarkierungstechniken unter Verwendung von Isotopenverhältnissen wie 3C/12C, 2H/1H und 18O/16O ein schnelles und zugängliches Mittel zur Untersuchung der Synthese-, Transport- und Speichermechanismen von Sekundärmetaboliten 7,8. Sie können die räumliche Verteilung von organischen Verbindungen und stabilen Isotopen in den Blättern aufdecken und ermöglichen so die Rekonstruktion der Umweltbedingungen, denen die Blätter während ihres gesamten Lebenszyklus ausgesetzt sind9. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung externer Isotopenmarkierungen wie 13C6-Glucose 10 und 13C 6-Phenylalanin11 die Erzeugung von kohlenstoffmarkierten Sekundärmetaboliten, wodurch unser Verständnis ihrer Produktion und Funktion verbessert wird.

Herkömmliche Techniken zur Markierung von Kohlenstoffisotopen stoßen aufgrund der hohen Speziesspezifität ihrer Biosynthesewege und Transportmechanismen auf Herausforderungen bei der Bestimmung der spezifischen Organe, die für die Synthese von Sekundärmetaboliten verantwortlich sind. Die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) hat sich in diesem Bereich zu einem wichtigen analytischen Instrument entwickelt, das eine robuste Methode zur Verfolgung exogener Isotope in der chemischen Synthese von Arzneimitteln und zur Untersuchung von In-vivo-Prozessen wie Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung bietet12. Die überlegene Sensitivität, Einfachheit und Zuverlässigkeit der LC-MS machen sie zur idealen Wahl für die Überwachung der Produktion von Sekundärmetaboliten in Pflanzen13. In jüngster Zeit ist LC-MS zunehmend für ihre Anwendung in externen Isotopenmarkierungstechniken beliebt geworden, die die Bewertung der Markierungseffizienz über verschiedene Proben hinweg ermöglichen. Diese Methodik bietet wichtige Einblicke in die Primärorgane, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind, und stellt eine unschätzbare Ergänzung zu biologischen Methoden zur Identifizierung der Syntheseorgane dieser Verbindungen dar14,15. Folglich erleichtert dieser Ansatz nicht nur den Vergleich der Markierungseffizienz zwischen verschiedenen Proben, sondern gibt auch Aufschluss über die Schlüsselorgane, die an der Bildung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten beteiligt sind, und verbessert so unser Verständnis ihrer Biosynthese.

Wir haben eine neuartige Methode eingeführt, die die Kohlenstoffisotopenmarkierung mit der LC-MS-Detektion kombiniert, um die primären Organe zu identifizieren, die für die Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen verantwortlich sind. Pariser Saponin (PS) hat eine Vielzahl von pharmakologischen Aktivitäten wie Krebsbekämpfung, Immunmodulation und entzündungshemmendeWirkung 16, und PPY ist zunehmend gefragt17. Daher haben wir PPY-Sämlinge als Forschungsobjekte verwendet und entschlüsselt, dass Blätter das primäre Organ für die Synthese des Pariser Saponins VII (PS VII) sind (Abbildung 1B), indem wir die 13C 6-Glukose-Markierung verwenden, die mit der LC-MS-Methode assoziiert ist. Unser Ansatz umfasste vier verschiedene Behandlungen, bei denen 13C6-Glukose an Blatt-, Rhizom- und Stammgefäßbündel gefüttert wurde, sowie eine Kontrolle ohne Fütterung. Die Wahl von 13C6-Glucose ist strategisch, da es über die Atmung schnell zu Acetyl-Coenzym A metabolisiert wird, das dann die PS-Synthese erleichtert. Unter Ausnutzung der natürlichen Häufigkeit von 13C verwendeten wir ein Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-IRMS), um die 13C/12C-Verhältnisse in verschiedenen Pflanzenorganen zu bewerten und die Isotopen-Ionen-Peak-Verhältnisse in PS VII- und Pariser Saponinen II (PS II) (Abbildung 1B) Molekülen zu analysieren. Unsere Methodik, die 13C-markierte pflanzliche Sekundärmetaboliten-Vorläufer und modernste Massenspektrometrietechniken nutzt, bietet eine einfachere und genauere Alternative zu herkömmlichen Methoden zur Markierung von Kohlenstoffisotopen. Dieser neuartige Ansatz vertieft nicht nur unser Verständnis der Organe, die an der Sekundärmetabolitensynthese in Heilpflanzen beteiligt sind, sondern legt auch eine solide Grundlage für zukünftige Erkundungen der Biosynthesewege dieser Verbindungen.

Protocol

1. Experimentelle Vorbereitung Achten Sie darauf, dass während des Pflanzenwachstums die relative Luftfeuchtigkeit des Gewächshauses 75 % beträgt, die Tag-/Nachttemperaturen 20 °C/10 °C betragen, die Photoperiode aus 12 Stunden Tag und 12 Stunden Nacht besteht und die Lichtintensität 100 μmolμm-2·s-1 beträgt. Sorgen Sie für Bestrahlungsstärke über Leuchtdioden (LED)-Lampen und halten Sie einen Abstand von 30 cm zwischen der LED-Lampe und dem Pflanzendach ein.<…

Representative Results

Um zu bestätigen, dass die Versorgung mit 13C6-Glukose in Rhizomen erfolgreich war, analysierten wir weiterhin die 13C/12C Isotopenverhältnisse in Rhizomen. Die 13C /12C Isotopenverhältnisse der Behandlungen 3 und 4 waren viel höher als die der Behandlung 2 (Abbildung 1A). Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass 13C6-Glukose aus den Behandlungen 3 und 4 durch Verschlucken in die Rhizome gelangte….

Discussion

Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls hängt von einer umfassenden Erforschung der physiologischen Eigenschaften, Gewebe, Organe und Sekundärmetaboliten der Pflanzen ab. Der im Protokoll skizzierte Ansatz des experimentellen Designs bildet eine solide Grundlage für die Untersuchung der Biosynthesewege pflanzlicher Sekundärmetaboliten. Die kritischen Faktoren in diesem Experiment sind (1) die Bestimmung des Alters der mehrjährigen Sämlinge und (2) die Wahl des richtigen Zeitpunkts für die Isotopenmarkierung u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Jugendprogramm der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82304670) finanziert.

Materials

0.1 % Formic acid water Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
13C6-Glucose powder MERCK 110187-42-3
Acetonitrile Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
AUTOSAMPLER VIALS Biosharp Biotechnology Company 44866
BEH C18 column Waters,Milfor,MA 1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software Thermo Scientific, Fremont,CA 3
Compound DiscovererTM  software  Thermo Scientific,Fremont,CA 3
Electric constant temperature blast drying oven DHG-9146A
Electronic analytical balance Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd SOP
Ethanol  Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44955
Fully automatic sample rapid grinder Shanghai Jingxin Technology Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer Thermo Fisher Delta V Advantage
Hoagland solution Sigma-Aldrich H2295-1L
Hydroponic tank JRD 1020421
Isodat software Thermo Fisher Scientific 3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry Agilent Technology  Agilent 1260 -6120 
Nitrogen manufacturing instrument PEAK SCIENTIFIC Genius SQ 24
Organic phase filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd 44890
Oxygen pump Magic Dragon MFL
Quantum sensor Highpoint UPRtek
Scalpel Handskit 11-23
Sprinkling can CHUSHI WJ-001
Xcalibur  software Thermo Fisher Scientific 4.2

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Chen, S., Chang, F., Lin, L., Wang, Y., Wen, F., Zhou, T., Pei, J. 13C6-Glucose Labeling Associated with LC-MS: Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis. J. Vis. Exp. (205), e66578, doi:10.3791/66578 (2024).

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