13 okt.C 6-glucose-etikettering geassocieerd met LC-MS: identificatie van primaire organen van planten in secundaire metabolietsynthese
Summary
De ontwikkelde methode van 13C 6-Glucose-etikettering in combinatie met vloeistofchromatografie met hoge resolutie massaspectrometrie is veelzijdig en legt de basis voor toekomstige studies naar de primaire organen en routes die betrokken zijn bij de synthese van secundaire metabolieten in medicinale planten, evenals het uitgebreide gebruik van deze secundaire metabolieten.
Abstract
Dit artikel presenteert een nieuwe en efficiënte methode voor het certificeren van primaire organen die betrokken zijn bij de synthese van secundaire metabolieten. Als belangrijkste secundaire metaboliet in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Paris saponine (PS) heeft een verscheidenheid aan farmacologische activiteiten en er is steeds meer vraag naar PPY . Deze studie stelde blad-, wortelstok- en stengel-vasculaire-bundel 13C6-Glucose voedende en niet-voedende vier behandelingen vast om de primaire organen die betrokken zijn bij de synthese van Paris saponinen VII (PS VII) nauwkeurig te certificeren. Door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) te combineren, werden de 13C/12C-verhoudingen van blad, wortelstok, stengel en wortel in verschillende behandelingen snel en nauwkeurig berekend, en werden vier soorten PS-isotopische ionenpiek (M−) verhoudingen gevonden: (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− en (M+4) −/M−. De resultaten toonden aan dat de verhouding van 13C/12C in de wortelstokken van de stengel-vaatbundel- en wortelstokvoedingsbehandelingen significant hoger was dan die in de niet-voedende behandeling. Vergeleken met de niet-voedende behandeling nam de verhouding van PS VII-moleculen (M+2) −/M− in de bladeren significant toe onder blad- en stengel-vasculaire-bundelvoedingsbehandelingen. Tegelijkertijd, vergeleken met de niet-voedende behandeling, vertoonde de verhouding van PS VII-moleculen (M+2) −/M− in de bladeren onder wortelstokbehandeling geen significant verschil. Bovendien vertoonde de verhouding van PS VII-moleculen (M+2) −/M− in de stengel, wortel en wortelstok geen verschillen tussen de vier behandelingen. Vergeleken met de niet-voedende behandeling vertoonde de verhouding van het Parijse saponine II (PS II) molecuul (M+2) –/M− in bladeren onder bladvoedende behandeling geen significant verschil, en de (M+3) –/M−-verhouding van PS II-moleculen in bladeren onder bladvoedende behandeling was lager. De gegevens bevestigden dat het primaire orgaan voor de synthese van PS VII de bladeren zijn. Het legt de basis voor toekomstige identificatie van de primaire organen en routes die betrokken zijn bij de synthese van secundaire metabolieten in geneeskrachtige planten.
Introduction
De biosynthetische routes van secundaire metabolieten in planten zijn ingewikkeld en divers, waarbij zeer specifieke en diverse accumulatieorganen betrokkenzijn1. Op dit moment zijn de specifieke syntheseplaatsen en verantwoordelijke organen voor secundaire metabolieten in veel geneeskrachtige planten niet goed gedefinieerd. Deze ambiguïteit vormt een aanzienlijk obstakel voor de strategische vooruitgang en implementatie van teeltmethoden die zijn ontworpen om zowel de opbrengst als de kwaliteit van medicinale materialen te optimaliseren.
Moleculaire biologie, biochemische en isotopenlabeltechnieken worden op grote schaal gebruikt om de syntheseroutes en -plaatsen van secundaire metabolieten in medicinale planten te ontrafelen 2,3,4,5, en elk van deze methodologieën vertoont unieke sterke punten en beperkingen, zoals verschillen in efficiëntie en nauwkeurigheid. Moleculair-biologische benaderingen bieden bijvoorbeeld een hoge precisie bij het lokaliseren van de locaties binnen biosynthetische routes, maar zijn opmerkelijk tijdrovend. Hun bruikbaarheid is verder beperkt voor soorten die geen openbaar beschikbare genomische sequenties hebben, waardoor deze technieken minder levensvatbaar zijn voor dergelijke gevallen6. Daarentegen bieden isotopenlabeltechnieken, waarbij gebruik wordt gemaakt van isotopenverhoudingen zoals 3C/12C, 2H/1H en 18O/16O, een snelle en toegankelijke manier om de synthese-, transport- en opslagmechanismen van secundaire metabolieten te onderzoeken 7,8. Ze kunnen de ruimtelijke verdeling van organische verbindingen en stabiele isotopen in bladeren onthullen, waardoor de milieuomstandigheden die de bladeren gedurende hun hele levenscyclus ervaren, kunnen worden gereconstrueerd9. Bovendien maakt de toepassing van externe isotopenlabels, zoals 13C6-Glucose 10 en 13C 6-Fenylalanine11, het genereren van met koolstof gelabelde secundaire metabolieten mogelijk, waardoor ons begrip van hun productie en functie wordt verbeterd.
Traditionele technieken voor het labelen van koolstofisotopen ondervinden uitdagingen bij het lokaliseren van de specifieke organen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van secundaire metabolieten vanwege de zeer soortspecifieke aard van hun biosynthetische routes en transportmechanismen. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) is bekend geworden als een cruciaal analytisch instrument in deze arena en biedt een robuuste methode voor het volgen van exogene isotopen in de chemische synthese van geneesmiddelen en het onderzoeken van in vivo processen zoals absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding12. De superieure gevoeligheid, rechtlijnigheid en betrouwbaarheid van LC-MS maken het een ideale keuze voor het bewaken van de productie van secundaire metabolieten in planten13. In de afgelopen tijd is LC-MS steeds meer geliefd geworden vanwege zijn toepassing in externe isotopenetiketteringstechnieken, waardoor de efficiëntie van de etikettering in verschillende monsters kan worden geëvalueerd. Deze methodologie biedt kritische inzichten in de primaire organen die betrokken zijn bij de synthese van secundaire metabolieten in medicinale planten, en dient als een onschatbare aanvulling op biologische methoden voor het identificeren van de syntheseorganen van deze verbindingen14,15. Bijgevolg vergemakkelijkt deze benadering niet alleen de vergelijking van de etiketteringsefficiëntie tussen verschillende monsters, maar werpt het ook licht op de belangrijkste organen die betrokken zijn bij de aanmaak van secundaire metabolieten van planten, waardoor ons begrip van hun biosynthese wordt verbeterd.
We hebben een nieuwe methode geïntroduceerd die koolstofisotopenlabeling combineert met LC-MS-detectie om de primaire organen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor het synthetiseren van secundaire metabolieten in medicinale planten. Parijse saponine (PS) heeft een verscheidenheid aan farmacologische activiteiten, zoals antikanker, immunomodulatie en ontstekingsremming16, en er is steeds meer vraag naar PPY17. Daarom gebruikten we PPY-zaailingen als proefpersonen en ontcijferden we dat bladeren het primaire orgaan zijn om de Parijse saponine VII (PS VII) (figuur 1B) te synthetiseren door gebruik te maken van de 13C 6-glucose-etikettering die verband houdt met de LC-MS-methode. Onze aanpak omvatte vier verschillende behandelingen waarbij 13C6-glucose zich voedde met blad-, wortelstok- en stengel-vasculaire bundels, evenals een niet-voedende controle. De keuze voor 13C6-glucose is strategisch, omdat het via ademhaling snel wordt gemetaboliseerd tot acetyl-co-enzym A, wat vervolgens de PS-synthese vergemakkelijkt. Gebruikmakend van de natuurlijke overvloed van 13C, gebruikten we een Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer (GC-IRMS) -systeem om de 13C/12C-verhoudingen in verschillende plantorganen te beoordelen en om de isotopische ionenpiekverhoudingen in PS VII- en Paris-saponinen II (PS II) (figuur 1B) moleculen te analyseren. Onze methodologie, die gebruikmaakt van 13C-gelabelde precursoren van secundaire metabolieten van planten en geavanceerde massaspectrometrietechnieken, biedt een eenvoudiger en nauwkeuriger alternatief voor conventionele etiketteringsmethoden voor koolstofisotopen. Deze nieuwe benadering verdiept niet alleen ons begrip van de organen die betrokken zijn bij de synthese van secundaire metabolieten in medicinale planten, maar legt ook een solide basis voor toekomstige verkenningen naar de biosynthetische routes van deze verbindingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De succesvolle implementatie van dit protocol staat of valt met uitgebreid onderzoek naar plantfysiologische eigenschappen, weefsels, organen en secundaire metabolieten. De experimentele ontwerpbenadering die in het protocol wordt beschreven, legt een robuuste basis voor het onderzoeken van de biosynthetische routes van secundaire metabolieten van planten. De kritische factoren in dit experiment zijn (1) het bepalen van de leeftijd van de meerjarige zaailingen en (2) het kiezen van de juiste timing voor het labelen en de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China’s Youth Program (nr. 82304670).
Materials
| 0.1 % Formic acid water | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| 13C6-Glucose powder | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitrile | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| AUTOSAMPLER VIALS | Biosharp Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 column | Waters,Milfor,MA | 1.7μm,2.1*100 mm | |
| CNC ultrasonic cleaner | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific,Fremont,CA | 3 | |
| Electric constant temperature blast drying oven | DHG-9146A | ||
| Electronic analytical balance | Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd | SOP | |
| Ethanol | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44955 | |
| Fully automatic sample rapid grinder | Shanghai Jingxin Technology | Tissuelyser-48 | |
| Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Hoagland solution | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| Hydroponic tank | JRD | 1020421 | |
| Isodat software | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry | Agilent Technology | Agilent 1260 -6120 | |
| Nitrogen manufacturing instrument | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| Organic phase filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| Oxygen pump | Magic Dragon | MFL | |
| Quantum sensor | Highpoint | UPRtek | |
| Scalpel | Handskit | 11-23 | |
| Sprinkling can | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
References
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
- Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349 (2023).
- Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421 (2019).
- Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
- Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101 (2011).
- Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
- Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42 (2014).
- Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
- Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
- Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
- Lozac’h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
- Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of > 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
- Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
- Jung, J. -. Y., Oh, M. -. K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
- Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293 (2021).
- Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
- Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
- Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
- Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311 (2023).
- Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038 (2021).
- Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
- Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites’ biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932 (2022).
- Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215 (2023).
- Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429 (2023).
- Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
- Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
- Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).
