Evaluación en tiempo real de la contractilidad absoluta, citosólica, libre de Ca²⁺ y correspondiente en vasos linfáticos aislados y presurizados

Se compraron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a 13 semanas de edad a un vendedor comercial. Después de su llegada, todas las ratas fueron alojadas y mantenidas en las instalaciones de la División de Medicina de Animales de Laboratorio (DLAM) de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (UAMS) con una dieta estándar de laboratorio y expuestas a 12 h de ciclo de luz-oscuridad a 25 oC. Todos los procedimientos se llevaron a cabo según el protocolo de uso animal aprobado #4127 por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la UAMS. 1. Disección y canulación de VI mesentéricos NOTA: Es importante configurar la cámara de perfusión antes del aislamiento de los VI mesentéricos para asegurarse de que no haya interrupciones en el flujo o fugas que puedan interrumpir el experimento. Preparación del baño de perfusiónCompre micropipetas de vidrio de borosilicato (1,2 mm de diámetro exterior, 0,68 mm de diámetro interior y tiradas hasta un diámetro de punta exterior de 75-100 μm) de un proveedor comercial. Corte y pula las micropipetas (también conocidas como cánulas) de aproximadamente 1-2 cm de longitud para montarlas en la cámara de perfusión del recipiente aislado. Conecte cada cánula de vidrio montada en la cámara de perfusión del recipiente a transductores de presión independientes situados en línea con reguladores de presión independientes alimentados por gravedad utilizando tubos de polietileno.NOTA: Esto permite la manipulación independiente de las presiones de entrada y salida según el diseño del estudio. En la figura 1 se muestra esta configuración en detalle. Rellene la cámara de perfusión (5 mL), las micropipetas de vidrio y el regulador de presión independiente alimentado por gravedad junto con los tubos de polietileno con solución salina fisiológica (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO3; 1,17 mM NaH2PO4; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO4; 5,5 mM C6H12O6 (glucosa); 0,026 mM C10H16N2O8 (EDTA); y 1,6 mM CaCl2) desprovisto de burbujas de aire. Luego, sujete la presión para que las cánulas no estén presurizadas.NOTA: El pH de esta solución es de ~7.5. Se mantiene un pH de 7,4 en el baño de perfusión utilizando burbujeo de CO2 para actuar sobre el sistema de amortiguación de bicarbonato dentro del PSS, como se describe en el paso 1.3.7. El EDTA se utiliza aquí para quelar el exceso de iones Ca2+ . Preparación de nudosAte nudos dobles por encima de la cabeza bajo el microscopio con hilo de sutura de seda trenzado (tamaño 8-0). Los pasos clave se ilustran en la Figura 2.Separa un solo filamento. Use dos pinzas Dumont # 5 con puntas microromas y con una pinza haga un bucle doble alrededor de la punta de las otras pinzas. Con las pinzas en asa, agarra el extremo suelto de la sutura y pásalo por ambos bucles asegurándote de no cerrar el nudo por completo y dejando una pequeña abertura. Use las tijeras de resorte Vanna para cortar el exceso de sutura de ambos lados. Utilice estos nudos más tarde para asegurar el VI en las cánulas.NOTA: No use las mismas pinzas con las que diseccionará o cánula porque existe más peligro de dañar las puntas de las pinzas durante el atado de nudos. Aislamiento y canulación de VI mesentéricosAnestesiar profundamente a los animales administrando un isoflurano al 5% con sobredosis deO2 de 1,5 L/min y desangrar por decapitación. Aísle mesenterios enteros para la disección de VI mesentéricos haciendo primero un corte longitudinal a lo largo de la línea media de la pared abdominal, exteriorizando el mesenterio y luego cortando la conexión justo debajo del esfínter pilórico y ~ 2-3 cm por encima del ciego, así como la conexión con el recto. Lave los mesenterios enteros disecados en 200 ml de PSS helado y luego transfiéralos y colóquelos en una placa de Petri (100 mm) revestida de silicona (8-10 mm) que contenga PSS helado. Diseccione los VI mesentéricos de segundo orden de la grasa circundante y el tejido conectivo utilizando un microscopio estereoscópico, pinzas finas Dumont #5 Inox y tijeras de resorte Vanna. Para ayudar a identificar los extremos de los VI una vez extraídos del tejido, deje un pequeño trozo de grasa en el extremo proximal del VI. Transfiera los VI disecados a la cámara de perfusión del vaso para la canulación en cánulas de vidrio. Utilice dos pinzas finas Dumont #5 Inox preafiladas, de punta recta (0,05 x 0,01 mm) para canular los VI con el extremo distal del VI en la cánula P1 (flujo de entrada) y el extremo proximal del vaso en la cánula P2 (flujo de salida) para imitar la dirección del flujo linfático.NOTA: Las cánulas P1 y P2 son idénticas y solo difieren en el extremo del VI que está conectado. Es importante utilizar pinzas que se unan perfectamente en la punta y sin daños para facilitar el agarre de la delgada pared del vaso.Deslice un solo nudo preatado en cada cánula de vidrio para luego asegurar el recipiente en las cánulas. Usando el pequeño trozo de grasa para ayudar a orientar la dirección del ventrículo izquierdo, primero cánula el extremo distal en P1. Deslice el nudo por la cánula y apriételo para asegurar el VI. Asegúrese de no apretar demasiado y romper la punta de la cánula. Presurizar el VI a 4-5 mm Hg en la cámara de perfusión.NOTA: Para nuestros propósitos, establecemos la presión P1 y P2 para que sean iguales; Sin embargo, dependiendo de las condiciones experimentales, la presión puede ajustarse en cada cánula para inducir esfuerzo cortante o reflujo. Repita los pasos 1.3.6.1-1.3.6.4 para canular el extremo proximal del VI en P2. Coloque la piedra burbujeante con 7% de dióxido de carbono (CO2) / 93% de oxígeno (O2) en la cámara de baño para mantener el pH fisiológico. Conecte la cámara al regulador de temperatura y ajústela a 37 oC para que los VI se equilibren y desarrollen contracciones estables y espontáneas (aproximadamente 30 min).NOTA: La Figura 1 muestra esta configuración en detalle. 2. Medición de las concentraciones absolutas de [Ca2+]i en los VI Tinción con Fura-2AM de VI canuladosDespués de que se desarrollen contracciones espontáneas (a partir del paso 1.3.8), incubar los VI con Fura-2-acetoximetílico éster (Fura-2AM; 2 μM o 10 μL/5 mL) y ácido plurónico (PA; 0,02% P/V o 5 μL/5 mL de 20% PA) durante 30 min en la oscuridad.NOTA: Después de la adición de Fura-2AM, todos los pasos restantes deben realizarse en la oscuridad. Después de 30 minutos, cambie la solución en la cámara de perfusión 3 veces vaciando todo el volumen del baño con un vacío de presión negativa, reemplazándolo con PSS sin reactivos a temperatura adaptada (37 oC).NOTA: Esto debe hacerse rápidamente para minimizar el tiempo que el VI está suspendido en el aire. Utilice ambas manos, por ejemplo, la mano derecha para aspirar y la mano izquierda para reemplazar el nuevo PSS sin reactivos. Después del lavado, incubar los VI durante 15 minutos en la oscuridad para eliminar el exceso de indicador y permitir la desesterificación. Captura de Ca2+ fluorescencia y diámetro de los vasosTransfiera la cámara a la platina de microscopio fluorescente invertido equipada con una fuente de luz LED, un objetivo S Fluor 20x, un adaptador de encuadre celular y un rápido sistema de cámara de video CMOS, que permite la captura de fluorescencia fotograma a fotograma a 15 Hz.NOTA: En la Figura 3 se presenta un esquema de esta configuración de flujo de trabajo. La señal Ca2+ se puede capturar con una cámara CCD con al menos 15 fps. Conecte el microscopio a la computadora equipada con software de imágenes para registrar la fluorescencia y la detección de bordes.NOTA: El software al que se hace referencia también permite el registro simultáneo de la presión; sin embargo, eso no está incluido aquí. Encienda la fuente de luz LED y la interfaz del sistema fluorescente.NOTA: Las instrucciones de software descritas aquí son para el software al que se hace referencia, pero se puede utilizar otro software para obtener estos datos. Software abierto (IonWizard). En la pestaña Archivo , seleccione Nuevo. En la pestaña Recopilar , seleccione Experimento. Cargue la plantilla experimental deseada y haga clic en Aceptar.NOTA: Deberá configurar una plantilla experimental con los parámetros que se van a medir. Las instrucciones para la configuración de la plantilla se pueden encontrar en el manual del software29. Ajuste los trazos en pantalla para ver el diámetro del recipiente, el numerador (señal 340), el denominador (señal 380) y la relación en orden descendente. Ajuste la escala del eje Y según sea necesario para ayudar a visualizar los seguimientos.En Seguimientos, seleccione Editar límites de usuarios. Asegúrese de que la opción Límites automáticos esté desactivada. Seleccione el parámetro que desea ajustar, introduzca los valores mínimo y máximo para el eje y, a continuación, seleccione Aceptar. Para comenzar el experimento, haga clic en INICIAR (en la parte inferior de la pantalla). Para medir el diámetro del VI simultáneamente, utilice el software de detección de bordes incorporado en el sistema de imagen, que genera trazas contráctiles de los VI a 3 Hz. Utilice estas mediciones para analizar los parámetros contráctiles y de ritmicidad descritos en la sección 3 y mostrados en la Figura 4.Asegúrese de ajustar la iluminación para que la pared del VI aparezca como líneas oscuras. Seleccione una región de interés (ROI) que esté desprovista de grasa y residuos. Una vez que el experimento haya comenzado, no mueva este ROI. Asegúrese de que el umbral esté configurado de modo que el borde de la pared del recipiente se detecte durante todo el ciclo de contracción. Para mediciones de fluorescencia, encienda el tubo fotomultiplicador (PMT). Excite Fura-2, un indicador radiométrico, alternando longitudes de onda de 340 y 380 nm en exposiciones de 50 ms utilizando iluminadores LED, y capture los espectros de emisión a 510 nm a 15 Hz en todo el campo de imagen.NOTA: Es importante mantener todos los parámetros ópticos (ajustes de excitación, filtros de emisión, lente del objetivo y espejos dicroicos) iguales durante toda una serie de experimentos para obtener mediciones de Ca2+ reproducibles. Mida la relación señal-fondo obteniendo primero la fluorescencia 340 y 380 con el VI en el centro del campo de visión (señal) y luego, utilizando los manipuladores de etapa para mover el campo de visión al borde del baño sin ningún recipiente (teniendo cuidado de evitar el borde revestido de silicona y/o eliminando cualquier residuo del baño) para capturar el fondo.NOTA: Es importante navegar de regreso a la sección original de la embarcación cada vez para las mediciones de Ca2+ . Cambie la solución de baño por PSS sin reactivos a temperatura adaptada para eliminar el indicador de exceso en el baño. Es posible que se necesiten varios intercambios de baño para eliminar el exceso de Fura-2, así que repita este intercambio hasta que la relación señal/fondo sea de aproximadamente 10:1. Registre la señal de fluorescencia de Fura-2 basal y las contracciones espontáneas durante aproximadamente 30 minutos, seguidas de una respuesta de concentración acumulativa de nifedipino (NIF; 0,1-100 nM), un antagonista de Cav1.x dependiente de voltaje. Obtenga mediciones de fondo para cada concentración de fármaco. Al final de cada experimento, lavar los VI con PSS libre de Ca2+ a temperatura ajustada para obtener la señal de fluorescencia mínima de Fura-2 (Rmin) y el diámetro máximo de los VI en ausencia de Ca2+. Asegúrate de medir el fondo.NOTA: El PSS libre de Ca2+ tiene la misma composición que el PSS pero sin CaCl2, y el EDTA se reemplaza por 1 mM EGTA (C14H24N2O10) (pH ~ 7.5). Cambie la solución de baño por PSS a temperatura adaptada que contenga 10 mM de Ca2+ e ionomicina (10 μM de IONO), un ionóforo de Ca2+ , para obtener la señal de fluorescencia máxima de Fura-2 (Rmáx) y el diámetro mínimo de los VI en condiciones de saturación de Ca2+. Asegúrate de medir el fondo. La fórmula para medir el absoluto [Ca2+]iUtilice Rmin y Rmax para calibrar la relación de longitudes de onda de 340 y 380 nm y calcular la concentración absoluta de Ca2+ libre citosólico ([Ca2+]i). Calcule la concentración absoluta de Ca2+ libre citosólico ([Ca2+]i) utilizando la ecuación (1)26:(1)Donde Kd = 225 nM (constante de disociación para Fura-2)26, R = relación 340/380, Rmin = relación 340/380 en ausencia de Ca2+, Rmax = relación 340/380 con condiciones de saturación de Ca2+, Slibre = señal de 380 en ausencia de Ca2+, Senlazada = señal de 380 con condiciones de saturación de Ca2+NOTA: Todas las señales fluorescentes se corrigieron para la fluorescencia de fondo. La Figura 5 es un ejemplo de seguimiento de Ca2+ que detalla qué parámetros se registran. Defina el Ca2+ de referencia como el Ca2+ en reposo más bajo antes del pico de Ca2+ y el pico Ca2+ como el Ca2+ más alto alcanzado durante el pico de Ca2+ . La amplitud es la diferencia entre el pico y la línea de base Ca2+. Exporte todos los parámetros directamente desde el software de imagen, excepto la frecuencia del pico de Ca2+ , que se calculará fuera de línea como el número de picos de Ca2+ /s. A continuación se muestran los pasos clave dentro del software al que se hace referencia para obtener estos parámetros.NOTA: Las trazas completas se pueden exportar a un archivo .txt y todos los parámetros se pueden analizar o calcular en el software de su elección. Para Rmin, resalte la sección de la traza del numerador que corresponde al fondo durante el PSS libre de Ca2+. Se abrirá un cuadro de diálogo y proporcionará los valores de esta parte del seguimiento. En Operaciones, seleccione Constantes. Seleccione Fondo numérico de calcio e ingrese los números de fondo para el numerador y el denominador del paso anterior. Haga clic en Aceptar. Resalte la sección de la traza de relación que corresponde a la relación más baja durante el PSS libre de Ca2+. Esto es Rmin. También tome nota del valor del denominador para esta sección; esto esS gratis. Repita los pasos 2.3.4 a 2.3.7 para Rmax y Senlazados con la sección de la traza que corresponde a un PSS libre de Ca2+ alto y una relación más alta. En Operaciones, seleccione Constantes. Seleccione Calibración de calcio-calcio e ingrese los valores enumerados en la Ecuación 1. Haga clic en Aceptar. Ajuste uno de los trazos en pantalla como se describe en el paso 2.2.8 para que pueda ver el calcio numérico restado. Realice un análisis transitorio monótono para adquirir los parámetros restantes. Las instrucciones para esto se pueden encontrar en el manual del software30. Como alternativa, en Exportar, seleccione Seguimiento actual. Seleccione la ubicación a la que desea exportar el archivo .txt y haga clic en Aceptar.NOTA: Asegúrese de hacer clic en la traza individual que desea exportar. Puede exportar todo el trazado o las secciones seleccionadas del mismo. 3. Medición de la contractilidad y ritmicidad del VI El software de detección de bordes incorporado en el sistema de imágenes genera trazas contráctiles para las mediciones del diámetro del VI como se ha descrito anteriormente. Utilice estas mediciones para analizar parámetros contráctiles y de ritmicidad. La Figura 4 es un ejemplo de traza contráctil que detalla qué parámetros contráctiles se van a registrar. Exporte todos los parámetros directamente desde el software de imagen utilizando la función de análisis de transitorios monotónicos en la traza de diámetro30, excepto la frecuencia de las contracciones, el flujo calculado y el intervalo, que deben calcularse sin conexión.NOTA: Las trazas completas se pueden exportar a un archivo de .txt y todos los parámetros se pueden analizar o calcular en el software de su elección utilizando las ecuaciones a continuación. EDD, ESD, amplitud, frecuencia y mediciones de caudal calculadoMedir los diámetros máximo y mínimo (diámetro diastólico final [EDD] y diámetro sistólico final [ESD], respectivamente) que pueden alcanzar los VI durante sus contracciones rítmicas y espontáneas. Calcule la amplitud de las contracciones (AMP) como la diferencia entre EDD y ESD. Calcule la frecuencia como el número de contracciones por período de medición (en s). Calcule el caudal calculado por μm utilizando la ecuación (2):Caudal calculado = π/4(EDD2- ESD2)F (2)Donde EDD2 = área de la sección transversal del vaso durante el estado relajado, ESD2 = medida del área de la sección transversal del vaso durante la constricción, F = frecuencia de contracciones/s Ritmo: tiempo de contracción y relajación:Otras medidas de la ritmicidad del VI son el tiempo de contracción y el tiempo de relajación. Defina el tiempo de contracción como el tiempo que tarda el VI en alcanzar la ESD con cada contracción. Defina el tiempo de relajación como el tiempo que tarda el VI en alcanzar el EDD para cada relajación, lo que dará una indicación general de la ritmicidad correlacionada con [Ca2+]i absoluto dentro de un marco de tiempo específico. Calcule el tiempo del intervalo (ΔT) a partir de la ecuación (3).Δt = t2 (ESD2)-t1 (ESD1) (3)