HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi
Summary
Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.
Abstract
Adeno ilişkili viral vektörler (AAV’ler), merkezi sinir sistemini (MSS) araştırmak için dikkate değer bir araçtır. AAV gibi yenilikçi kapsidler. PHP.eB, farelerde intravenöz enjeksiyon ile CNS’nin kapsamlı transdüksiyonunu gösterir. Karşılaştırılabilir transdüksiyon elde etmek için, CNS parankiminde doğrudan enjeksiyona kıyasla 100 kat daha yüksek bir titre (minimum 1 x 1011 genom kopyası / fare) gereklidir. Grubumuzda, AAV dahil olmak üzere AAV üretimi. PHP.eB, yapışık HEK293T hücrelerine ve üçlü transfeksiyon yöntemine dayanır. Yapışık hücrelerle yüksek AAV verimleri elde etmek, emek ve malzeme yoğun bir süreç gerektirir. Bu kısıtlama, konik tüplerde süspansiyon bazlı hücre kültürü için bir protokolün geliştirilmesine yol açtı. Yapışık hücrelerde üretilen AAV’ler, süspansiyon üretim yöntemiyle karşılaştırıldı. Transfeksiyon reaktifleri Polietilenimin veya TransIt kullanılarak süspansiyon halindeki kültür karşılaştırıldı. AAV vektörleri, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjlemesi ve ardından bir santrifüj filtre kullanılarak tampon değişimi ve konsantrasyonu ile saflaştırıldı. Yapışık yöntemle ortalama 2.6 x 1012 genom kopyası (GC) elde ederken, süspansiyon yöntemi ve Polietilenimin toplamda 7.7 x 1012 GC ve TransIt toplamda 2.4 x 1013 GC verdi. Yapışık olarak üretilen vektörler arasında süspansiyon hücre sistemine göre in vivo transdüksiyon verimliliği açısından bir fark yoktur. Özetle, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü tanıtıldı, bu da vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azalmasına neden olurken, araştırma amacıyla ticari satıcılardan temin edilen bileşenleri kullanarak 3 ila 9 kat daha yüksek verim elde etti.
Introduction
Adeno-ilişkili virüs (AAV) 1965 yılında keşfedildi ve o zamandan beri sayısız uygulamada kullanıldı1. AAV’ler, sinirbilim araştırmalarında gen ve nöronal fonksiyonu incelemek, nörodevreleri haritalamak veya hastalık2 için hayvan modelleri üretmek için uygulanmıştır. Geleneksel olarak, çoğu doğal serotip kan-beyin bariyerini geçmediğinden veya bunu yapmak için yüksek bir doza ihtiyaç duymadığından, bu doğrudan ilgilenilen bölgeye enjekte edilerek yapılır 1,2,3.
AAV’nin keşfi ile. PHP.B4 ve AAV gibi yeni nesil kapsidler. PHP.eB5 ve AAV. CAP-B106, basit bir sistemik enjeksiyon kullanarak merkezi sinir sistemini (CNS) hedeflemek mümkündür. Uzamsal haritalama, AAV tarafından hedeflenen hücreleri ortaya çıkarır. Hücresel düzeydePHP.eB 6,7. Spesifik promotörler/arttırıcılar ile kombinasyon halinde, bu kapsidler, sinirbilimcilerin non-invaziv AAV iletimi ile genleri ve beyin fonksiyonlarını incelemeleri için kapsamlı fırsatlar sunar 4,8.
AAV için daha düşük bir doz gerekirken. PHP.eB (tipik olarak 1 ila 5 x 1011 Genom Kopyası (GC)/fare) AAV9 (4 x 1012 GC/fare)7 ile karşılaştırıldığında, doğrudan enjeksiyon stratejilerine (tipik olarak 1 x 109 GC/μL enjeksiyon) kıyasla daha fazla vektör üretilmesi gerekir. Çoğu doğal serotip, iyodiksanol saflaştırması 9,10,11,12 ile kombinasyon halinde klasik yapışık hücre kültürü sistemi kullanılarak üretilebilir. AAV için. PHP.eB bu, bir deney8 için yeterli vektörleri elde etmek için hücreleri kültürlemek ve transfekte etmek için emek yoğun bir süreç gerektirir. Bu nedenle, konik tüplerde süspansiyon hücre kültüründe AAV üretimi geliştirilmiştir. 300 mL’ye kadar kapasiteye sahip konik borular kompakttır ve hem inkübatör alanından hem de plastikten tasarruf sağlar. Süspansiyon hücrelerinin kültürlenmesi ve büyük miktarlarda işlenmesi, 15 cm’lik plakalar üzerindeki yapışık hücrelere göre çok daha kolaydır. Protokolün transfeksiyon bileşenleri aynı kalır. Bu nedenle, daha önce yapışık sistemle kullanılan plazmitler, süspansiyon hücrelerinde üretime dayalı olarak bu protokolde rahatlıkla kullanılabilir. Protokol, laboratuvardaki diğer araştırmacılara başarıyla aktarıldı ve çeşitli kapsidler ve yapılar için başarıyla kullanıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV’nin sistemik uygulaması, CNS’ye gen transferi için güçlü bir araçtır; ancak AAV üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Süspansiyon hücreleri kullanılarak, 15cm2’lik plakalar üzerindeki HEK293T yapışan kültüre kıyasla işçilik ve plastikler azaltılır. Ayrıca, burada uygulanan konik boruların kullanımı kolaydır ve laboratuvar alanı kullanımını en üst düzeye çıkarır. Protokol iki araştırmacı tarafından oluşturuldu ve daha sonra laboratuvardaki diğer kişiler taraf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) araştırma fonundan bir hibe ve Start2Cure’dan (0-TI-01) bir hibe ile desteklenmiştir. Protokolün kurulumundaki katkıları ve tavsiyeleri için Leisha Kopp’a teşekkür ederiz. Figürler Biorender kullanılarak oluşturuldu.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
