HEK293浮遊細胞を用いた高収率アデノ関連ベクターバッチの作製(英語)
Summary
ここでは、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルを提示し、その結果、商用ベンダーから研究目的で入手可能なコンポーネントを使用してベクターを生産するために必要な時間と労力を削減します。
Abstract
アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)は、中枢神経系(CNS)を調査するための優れたツールです。AAVなどの革新的なカプシド。PHP.eBは、マウスの静脈内注射による中枢神経系の広範な形質導入を示しています。同等の形質導入を実現するには、中枢神経系実質への直接注入と比較して、100倍高い力価(最小1 x 1011 ゲノムコピー/マウス)が必要です。私たちのグループでは、AAVを含むAAV生産。PHP.eBは、接着HEK293T細胞とトリプルトランスフェクション法に依存しています。接着細胞でAAVの高収率を達成するには、労力と材料を大量に消費するプロセスが必要です。この制約により、コニカルチューブでの懸濁液ベースの細胞培養のプロトコルが開発されました。接着細胞で生成したAAVを懸濁液製造法と比較しました。トランスフェクション試薬ポリエチレンイミンまたはTransItを用いた懸濁液中での培養を比較しました。AAVベクターは、ヨウジキサノールグラジエント超遠心分離により精製し、その後、バッファー交換および遠心フィルターを用いた濃縮を行いました。アドヒレント法では平均2.6 x 1012 GCを達成したが、懸濁法とポリエチレンイミンでは合計7.7 x 1012 GC、TransItでは合計2.4 x 1013 GCであった。接着液で作製したベクター間の in vivo 形質導入効率は、浮遊細胞系と比較して差はありません。要約すると、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルが導入され、ベクター生産に必要な時間と労力が削減され、研究目的で商用ベンダーから入手可能なコンポーネントを使用して3〜9倍の収率を達成します。
Introduction
アデノ随伴ウイルス(AAV)は1965年に発見され、それ以来、無数の用途で使用されてきました1。AAVは、遺伝子や神経細胞の機能の研究、神経回路のマッピング、疾患の動物モデルの作成など、神経科学研究に応用されています2。伝統的に、これはほとんどの自然な血清型が血液脳関門を通らないか、またはそうするために高線量を必要とするので、興味のある部位に直接注入することによって行われます1,2,3。
AAVの発見により。PHP.B4 や AAV などの次世代の capsid です。PHP.eB5 と AAV.CAP-B106は、簡易な全身注射を用いて中枢神経系(CNS)を標的とすることができる。空間マッピングにより、AAV の標的となる細胞が明らかになります。PHP.eB(セルラーレベル6,7)。これらのカプシドは、特定のプロモーター/エンハンサーと組み合わせることで、神経科学者が非侵襲的なAAV送達によって遺伝子と脳機能を研究する幅広い機会を提供します4,8。
AAVにはより低い用量が必要ですが。AAV9(4 x 1012 GC/マウス)と比較して、PHP.eB(通常1〜5 x 1011 11ゲノムコピー(GC)/マウス)7は、直接注入戦略(通常1 x 109 GC/μL注入)と比較して、さらに多くのベクターを作製する必要があります。ほとんどの天然血清型は、ヨージキサノール精製9,10,11,12と組み合わせた古典的な接着細胞培養システムを使用して作製できます。AAVの場合。PHP.eB:これは、1回の実験に十分なベクターを得るために、細胞を培養およびトランスフェクションするための労働集約的なプロセスを伴います8。そこで、コニカルチューブでの浮遊細胞培養におけるAAVの生産が開発されました。最大容量300mLのコニカルチューブはコンパクトで、インキュベーターのスペースとプラスチックの両方を節約できます。浮遊細胞は、15 cmプレート上の接着細胞よりも大量に培養および処理がはるかに簡単です。プロトコルのトランスフェクションコンポーネントは変わりません。したがって、以前に接着系で使用されたプラスミドは、浮遊細胞での産生に基づいて、このプロトコルで容易に使用できます。このプロトコルは、研究室の他の研究者への転送に成功し、さまざまなカプシドやコンストラクトに使用されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
AAVの全身投与は、中枢神経系への遺伝子導入のための強力なツールです。しかし、AAVの製造は高価で手間のかかるプロセスです。浮遊細胞を使用することで、15cm2 プレート上のHEK293Tの接着培養と比較して、労力とプラスチックが削減されます。さらに、ここに実装されている円錐形のチューブは取り扱いが簡単で、実験室のスペースを最大限に活用できます。このプロトコルは、2人…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オランダ王立芸術科学アカデミー(KNAW)研究基金からの助成金とStart2Cure(0-TI-01)からの助成金によって支援されました。プロトコルの設定における Leisha Kopp 氏の意見とアドバイスに感謝します。図はBiorenderを使用して作成されました。
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
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