ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293
Summary
כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.
Abstract
וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) הם כלי יוצא דופן לחקר מערכת העצבים המרכזית (CNS). קפסידים חדשניים, כגון AAV. PHP.eB, להדגים התמרה נרחבת של CNS על ידי הזרקה תוך ורידי בעכברים. כדי להשיג התמרה דומה, יש צורך בטיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 1011 עותקי גנום / עכבר) בהשוואה להזרקה ישירה בפרנכימה CNS. בקבוצה שלנו, ייצור AAV, כולל AAV. PHP.eB מסתמך על תאי HEK293T דבקים ועל שיטת הטרנספקציה המשולשת. השגת תפוקות גבוהות של AAV עם תאים דבקים כרוכה בתהליך עתיר עבודה וחומר. אילוץ זה הניע פיתוח פרוטוקול לתרבית תאים מבוססת השעיה בצינורות חרוטיים. AAVs שנוצרו בתאים דבקים הושוו לשיטת ייצור התרחיף. תרבית בהשעיה באמצעות ריאגנטים transfection Polyethylenimine או TransIt הושוו. וקטורי AAV טוהרו על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואחריה חילופי חיץ וריכוז באמצעות מסנן צנטריפוגלי. בשיטה הדבקה השגנו ממוצע של 2.6 x 1012 עותקי גנום (GC), בעוד ששיטת ההשעיה והפוליאתילנימין הניבו 7.7 x 1012 GC בסך הכל, ו- TransIt הניב 2.4 x10 13 GC בסך הכל. אין הבדל ביעילות התמרת vivo בין וקטורים המיוצרים עם דבק בהשוואה למערכת תאי התלייה. לסיכום, פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתרחיף מוצג, וכתוצאה מכך כמות מופחתת של זמן ועבודה הדרושים לייצור וקטורי תוך השגת תפוקות גבוהות פי 3 עד 9 באמצעות רכיבים הזמינים מספקים מסחריים למטרות מחקר.
Introduction
וירוס הקשור לאדנו (AAV) התגלה בשנת 1965 ומאז נעשה בו שימוש במספר עצום של יישומים1. AAVs יושמו במחקר מדעי המוח כדי לחקור גנים ותפקוד עצבי, למפות מעגלים עצביים, או לייצר מודלים של בעלי חיים למחלות2. באופן מסורתי, זה נעשה על ידי הזרקה ישירות באתר של עניין, כמו רוב הסרוטיפים הטבעיים אינם חוצים את מחסום הדם-מוח או צריך מינון גבוה לעשות זאת 1,2,3.
עם גילוי AAV. PHP.B4 וקפסידים מהדור הבא כגון AAV. PHP.eB5 ו- AAV. CAP-B106, ניתן לכוון את מערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות הזרקה מערכתית פשוטה. מיפוי מרחבי חושף את התאים שאליהם מכוון AAV. PHP.eB ברמה סלולרית 6,7. בשילוב עם מקדמים/משפרים ספציפיים, קפסידים אלה מציעים הזדמנויות נרחבות למדעני מוח לחקור גנים ותפקוד המוח על ידי אספקת AAV לא פולשנית 4,8.
בעוד מינון נמוך יותר נדרש עבור AAV. PHP.eB (בדרך כלל 1 עד 5 x 1011 עותקי גנום (GC) / עכבר) בהשוואה ל- AAV9 (4 x10 12 GC / עכבר)7, עדיין יש לייצר יותר וקטור בהשוואה לאסטרטגיות הזרקה ישירה (בדרך כלל 1 x 109 GC / μL הזרקה). ניתן לייצר את רוב הסרוטיפים הטבעיים באמצעות מערכת תרבית התאים הדבקה הקלאסית בשילוב עם טיהור יודיקסנול 9,10,11,12. עבור AAV. PHP.eB זה כרוך בתהליך עתיר עבודה לתרבית ולהעברת תאים כדי להשיג מספיק וקטורים לניסוי אחד8. לכן, פותח ייצור AAV בתרבית תאי השעיה בצינורות חרוטיים. צינורות חרוטיים, עם קיבולת של עד 300 מ”ל, הם קומפקטיים, חוסך הן שטח אינקובטור פלסטיק. תאי תרחיף הרבה יותר קלים לתרבית ולטיפול בכמויות גדולות מאשר תאים דבקים על לוחות 15 ס”מ. רכיבי הטרנספקציה של הפרוטוקול נשארים זהים. לכן, פלסמידים ששימשו בעבר עם מערכת דבק ניתן בקלות להשתמש בפרוטוקול זה מבוסס על ייצור בתאי ההשעיה. הפרוטוקול הועבר בהצלחה לחוקרים אחרים במעבדה ושימש בהצלחה לקפסידים ומבנים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניהול מערכתי של AAV הוא כלי רב עוצמה להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית; עם זאת, הייצור של AAV הוא תהליך יקר ומייגע. על ידי שימוש בתאי תרחיף, העבודה והפלסטיק מופחתים בהשוואה לתרבית הדבקה של HEK293T על 15 ס”מ2 צלחות. יתר על כן, הצינורות החרוטיים המיושמים כאן קלים לטיפול וממקסמים את השימוש בחלל המ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן המחקר של האקדמיה המלכותית ההולנדית לאמנויות ולמדעים (KNAW) ומענק מ-Start2Cure (0-TI-01). אנו מודים ללישה קופ על תרומתה ועצותיה בהגדרת הפרוטוקול. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
