Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen
Summary
Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.
Abstract
Adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV’s) zijn een opmerkelijk hulpmiddel voor het onderzoeken van het centrale zenuwstelsel (CZS). Innovatieve capsiden, zoals AAV. PHP.eB, demonstreren uitgebreide transductie van het CZS door intraveneuze injectie bij muizen. Om een vergelijkbare transductie te bereiken, is een 100 keer hogere titer (minimaal 1 x 1011 genoomkopieën/muis) nodig in vergelijking met directe injectie in het CZS-parenchym. In onze groep, AAV-productie, inclusief AAV. PHP.eB vertrouwt op adherent HEK293T cellen en de drievoudige transfectiemethode. Het bereiken van hoge opbrengsten van AAV met aanhangende cellen brengt een arbeids- en materiaalintensief proces met zich mee. Deze beperking leidde tot de ontwikkeling van een protocol voor celkweek op basis van suspensie in conische buizen. AAV’s gegenereerd in aanhangende cellen werden vergeleken met de productiemethode van de suspensie. Cultuur in suspensie met behulp van transfectiereagentia polyethylenimine of transit werd vergeleken. AAV-vectoren werden gezuiverd door ultracentrifugatie met jodixanolgradiënt, gevolgd door bufferuitwisseling en concentratie met behulp van een centrifugaalfilter. Met de adherente methode bereikten we een gemiddelde van 2,6 x 1012 genoomkopieën (GC) in totaal, terwijl de suspensiemethode en polyethylenimine in totaal 7,7 x 1012 GC opleverden en TransIt in totaal 2,4 x 1013 GC opleverde. Er is geen verschil in in vivo transductie-efficiëntie tussen vectoren geproduceerd met adhesief in vergelijking met het suspensiecelsysteem. Samenvattend wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol geïntroduceerd, wat resulteert in een verminderde hoeveelheid tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie, terwijl 3 tot 9 keer hogere opbrengsten worden bereikt met behulp van componenten die beschikbaar zijn bij commerciële leveranciers voor onderzoeksdoeleinden.
Introduction
Adeno-geassocieerd virus (AAV) werd ontdekt in 1965 en is sindsdien gebruikt in een groot aantaltoepassingen1. AAV’s zijn toegepast in neurowetenschappelijk onderzoek om gen- en neuronale functies te bestuderen, neurocircuits in kaart te brengen of diermodellen voor ziekte2 te produceren. Traditioneel wordt dit gedaan door rechtstreeks op de plaats van belang te injecteren, aangezien de meeste natuurlijke serotypen de bloed-hersenbarrière niet passeren of een hoge dosis nodig hebben om dit te doen 1,2,3.
Met de ontdekking van AAV. PHP.B4 en capsiden van de volgende generatie, zoals AAV. PHP.eB5 en AAV. CAP-B106, is het mogelijk om het centrale zenuwstelsel (CZS) aan te pakken met behulp van een eenvoudige systemische injectie. Ruimtelijke toewijzing onthult de cellen waarop AAV zich richt. PHP.eB op cellulair niveau 6,7. In combinatie met specifieke promotors/enhancers bieden deze capsiden uitgebreide mogelijkheden voor neurowetenschappers om genen en hersenfunctie te bestuderen door middel van niet-invasieve AAV-afgifte 4,8.
Terwijl een lagere dosis nodig is voor AAV. PHP.eB (typisch 1 tot 5 x 1011 genoomkopieën (GC)/muis) in vergelijking met AAV9 (4 x 1012 GC/muis)7, moet er nog meer vector worden geproduceerd in vergelijking met directe injectiestrategieën (meestal 1 x 109 GC/μL injectie). De meeste natuurlijke serotypen kunnen worden geproduceerd met behulp van het klassieke aanhangende celkweeksysteem in combinatie met jodixanolzuivering 9,10,11,12. Voor AAV. PHP.eB dit houdt een arbeidsintensief proces in om cellen te kweken en te transfecteren om voldoende vectoren te verkrijgen voor één experiment8. Daarom werd de productie van AAV in suspensiecelkweek in conische buizen ontwikkeld. Conische buizen, met een capaciteit tot 300 ml, zijn compact, waardoor zowel couveuseruimte als kunststoffen worden bespaard. Suspensiecellen zijn veel gemakkelijker te kweken en in grote hoeveelheden te hanteren dan hechtende cellen op platen van 15 cm. De transfectiecomponenten van het protocol blijven hetzelfde. Daarom kunnen plasmiden die eerder met het aanhangende systeem werden gebruikt, gemakkelijk in dit protocol worden gebruikt op basis van productie in suspensiecellen. Het protocol werd met succes overgedragen aan andere onderzoekers in het laboratorium en met succes gebruikt voor verschillende capsiden en constructen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Systemische toediening van AAV is een krachtig hulpmiddel voor genoverdracht naar het CZS; de productie van AAV is echter een duur en arbeidsintensief proces. Door gebruik te maken van suspensiecellen worden arbeid en kunststoffen verminderd in vergelijking met de hechtende cultuur van HEK293T op platen van 15cm2 . Bovendien zijn de hier geïmplementeerde conische buizen gemakkelijk te hanteren en maximaliseren ze het gebruik van de laboratoriumruimte. Het protocol is opgezet door twee onderzoekers en vervolge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het onderzoeksfonds van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (KNAW) en een subsidie van Start2Cure (0-TI-01). Wij danken Leisha Kopp voor haar inbreng en advies bij het opzetten van het protocol. Figuren zijn gemaakt met behulp van Biorender.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
