Kernisolierung aus kryokonservierten in vitro gewonnenen Blutzellen

Die Hämatopoese ist ein relativ gut charakterisiertes Entwicklungssystem, aber die Unfähigkeit, die Blutzellbildung in vitro zu rekapitulieren, zeigt ein unvollständiges Verständnis der damit verbundenen Faktoren. Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Hämatopoesemodelle können dazu beitragen, wichtige Entwicklungsfaktoren und die damit verbundene Biologie aufzuklären. Das iPSC-System bietet auch ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Bluterkrankungen, und iPSC-basierte Blutzellen wurden entwickelt, um translational und therapeutisch relevante Reagenzien herzustellen 1,2,3,4. Einzelzellstudien wurden ausgiebig eingesetzt, um die iPSC-basierte Entwicklungsbiologie zu untersuchen, einschließlich der Zelltypen, die während der Hämatopoese gebildet werden⁵. Im Vergleich zur Massen-RNA-Sequenzierung, bei der keine Beziehungen zwischen Zellsubpopulationen abgeleitet werden können⁶, ermöglichen Einzelzellmodalitäten die Beurteilung der Zellheterogenität und können die Identifizierung und Charakterisierung der Zellentwicklung erleichtern ^6,7.

Die Bildung hämatopoetischer Zellen aus iPSCs erfordert eine sequentielle Differenzierung durch primitive Streifen-, Mesoderm- und Endothelzustände, um hämogene Endothelzellen zu bilden. Hämogene Endothelzellen sind direkte Vorläufer von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen⁸. Diese Zelltypen haben bemerkenswert unterschiedliche morphologische und zelluläre Eigenschaften. Es gibt ein begrenztes Verständnis der epigenetischen Landschaft und der Entwicklungsdynamik von in vitro abgeleiteten hämatopoetischen Zellmodellen, obwohl dies ein wesentliches Wissen ist, um das volle therapeutische Potenzial des iPSC-Systems auszuschöpfen. In vielen Fällen ermöglichen nur Einzelzellanalysemodalitäten die Identifizierung von Zellpopulationen, transkriptionellen Aktivitäten, Chromatinlandschaften und Regulationsmechanismen, die die Entwicklung heterogener Zellpräparate steuern.

Zwei Methoden, die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq), können transkriptionelle Erkenntnisse auf Einzelzellebene liefern⁹. Ein Hauptfaktor, der die Gültigkeit und Zuverlässigkeit der Daten bestimmt, ist der kompromisslose Bedarf an Proben, die strenge Qualitätskriterien erfüllen. Dazu gehören genaue Anforderungen an die Zell-/Kerndichte, optimale Viabilität und minimale Verklumpung. Die Präparation einzelner Zellkerne kann eine technische Herausforderung darstellen. Zusätzliche Herausforderungen können mit der Verwendung von zuvor kryokonservierten Zellen verbunden sein.

Wir weisen auf vier wichtige potenzielle Einschränkungen von Standard-scRNAseq-Ansätzen hin. Erstens beziehen sich Standardprotokolle zur Erzeugung von Zellsuspensionen oft auf Präparate aus frischen Zellen oder Geweben und nicht auf solche, die nach der Kryokonservierung gewonnen wurden¹⁰. Dies kann den Nutzen potenziell wertvoller Ressourcen einschränken. Zweitens ist die Dissoziationseffizienz verschiedener Zelltypen variabel. Zum Beispiel durchlaufen viele Immunzelltypen die Dissoziation relativ leicht. Im Gegensatz dazu haben Stromazellen, Fibroblasten und Endothelzellen, die normalerweise in die extrazelluläre Matrix und Basalmembran eingebettet sind, einzigartige Zelleigenschaften, die die Isolierung von Zellkernen erschweren können^11,12. Diese Eigenschaften können aggressive Dissoziationsprotokolle erforderlich machen, die die strukturelle Integrität empfindlicherer Zellpopulationen gefährden können. Drittens können einige Zellen (z. B. Megakaryozyten) einen Durchmesser von mehr als 100 μm erreichen und stellen Schwierigkeiten für mehrere bestehende kommerzielle Einzelzellplattformen dar¹³. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Handhabung zu zellulären Schäden und Stressreaktionen während der ersten Schritte der Zellisolierung führen, einschließlich enzymatischer Hydrolyse und mechanischer Dissoziation, was sich auf die Genexpressionsprofile auswirken kann^11,14.

Aus diesen und anderen Gründen kann ein Einzelkernansatz eine bevorzugte Alternative zu Einzelzellmethoden sein¹⁵. Aufgrund der überlegenen Stabilität der Kernmembran im Vergleich zur Zellmembran kann die Kernhülle auch nach der Kryokonservierung des Gewebes intakt bleiben¹⁶. Dies kann die Kernextraktion erleichtern und die Vielfalt der Probentypen erhöhen, die für Next-Generation-Sequencing-Modalitäten geeignet sind. Zweitens weisen die Zellkerne eine erhöhte Resistenz gegen mechanische Störungen auf und neigen dazu, während der Dissoziation weniger transkriptionelle Verschiebungen zu manifestieren¹⁴. Daher können Zellkerne eine höhere RNA-Stabilität und reproduzierbarere Transkriptionsprofile bieten. Ein dritter bemerkenswerter Vorteil von Einzelkernmethoden ist das Fehlen von Zellgrößenbeschränkungen und die Anwendbarkeit für größere Zellen wie Kardiomyozyten oder Megakaryozyten¹². Viertens dienen Zellkerne als geeignete Substrate für Multiomics-Analysen, die erweiterte Einblicke aus der integrierten Analyse der Genexpression, der zugänglichen Chromatinregionen und anderer Parameter¹⁷ bieten und ein tieferes Verständnis der Zellheterogenität, der Entwicklung und der Funktionszustände^{ermöglichen 18}.

Durch die Profilierung von iPSCs während der hämatopoetischen Entwicklung können Multiomics-Ansätze dazu beitragen, Entwicklungsprozesse in normalen oder pathologischen Krankheitsmodellen zu definieren. Vergleiche von iPSC-abgeleiteten Zellen mit primären Zellen oder Geweben können auch eine Bewertung der Treue des iPSC-Modells zur In-vivo-Biologie liefern, was die Verbesserung des iPSC-Modells und die Entdeckung neuer Zellpopulationen und Faktoren, die die Blutbildung vorantreiben, erleichtert.

Obwohl viele Gruppen die nukleare Isolierung und die daraus resultierende Sequenzierungsanalyse der nächsten Generation erfolgreich bewältigt haben, bleibt die Isolierung hochwertiger Kerne ein Hindernis für einige Laboratorien, die an der Durchführung von Einzelkernanalysen interessiert sind. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus zuvor kryokonservierten iPSC-abgeleiteten Zellen. Wir haben uns auf adhärente Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärente hämatopoetische Vorläuferzellen konzentriert, da diese in Struktur und Inhalt sehr unterschiedliche Zelltypen repräsentieren, die maßgeschneiderte Modifikationen und Fehlerbehebungen erfordern, um die Rückgewinnung hochwertiger Zellkerne zu verbessern, die für die Sequenzierung der nächsten Generation oder andere Experimente geeignet sind.