Dondurularak Saklanmış İn Vitro Kaynaklı Kan Hücrelerinden Nükleer İzolasyon
Summary
Tek çekirdekli yeni nesil dizileme analizlerini desteklemek için kriyoprezervasyonlu indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli stromal/endotel ve kan hücresi tiplerinden yüksek kaliteli çekirdeklerin çıkarılması için bir protokol açıklıyoruz. Yüksek kaliteli, sağlam çekirdekler üretmek, multiomik deneyler için zorunludur, ancak bazı laboratuvarlar için sahaya giriş için bir engel olabilir.
Abstract
İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı modeller, kan gelişimini anlamak için mükemmel platformlardır ve iPSC’den türetilen kan hücreleri, klinik test reaktifleri ve transfüzyon hücre terapötikleri olarak translasyonel faydaya sahiptir. Tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNAseq) ve Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi için Test (snATACseq) dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere multiomik analizin ortaya çıkışı ve genişlemesi, hücre gelişimi anlayışımızda devrim yaratma potansiyeli sunar. Bu, in vitro hematopoietik modeller kullanan gelişimsel biyolojiyi içerir. Bununla birlikte, bozulmamış çekirdekleri kültürlenmiş veya birincil hücrelerden izole etmek teknik olarak zor olabilir. Farklı hücre tipleri genellikle hücresel sertliğe ve içeriğe bağlı olarak özel nükleer preparatlar gerektirir. Bu teknik zorluklar veri kalitesini sınırlayabilir ve multiomik çalışmaları sürdürmek isteyen araştırmacılar için bir engel teşkil edebilir. Hücre toplama ve/veya işleme ile ilgili sınırlamalar nedeniyle numune kriyoprezervasyonu genellikle gereklidir ve donmuş numuneler, bozulmamış nükleer izolasyon için ek teknik zorluklar ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, tek çekirdekli multiomik iş akışlarında kullanılmak üzere in vitro hematopoietik gelişimin farklı aşamalarında iPSC’den türetilmiş hücrelerden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Yöntem geliştirmeyi, iPSC’den türetilen yapışık stromal/endotelyal hücrelerden ve yapışık olmayan hematopoietik progenitör hücrelerden çekirdeklerin izolasyonu üzerine odakladık, çünkü bunlar yapısal ve hücresel kimlik açısından çok farklı hücre tiplerini temsil eder. Açıklanan sorun giderme adımları, nükleer topaklanmayı ve döküntüleri sınırlayarak, sonraki analizler için çekirdeklerin yeterli miktar ve kalitede geri kazanılmasına izin verdi. Benzer yöntemler, çekirdekleri diğer kriyoprezervasyonlu hücre tiplerinden izole etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Hematopoez nispeten iyi karakterize edilmiş bir gelişimsel sistemdir, ancak in vitro olarak kan hücresi oluşumunu özetleyememe, ilgili faktörlerin eksik bir şekilde anlaşıldığını gösterir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı hematopoez modelleri, temel gelişimsel faktörlerin ve ilgili biyolojinin aydınlatılmasına yardımcı olabilir. iPSC sistemi ayrıca kan bozukluklarını incelemek için mükemmel bir model sunar ve iPSC bazlı kan hücreleri, translasyonel ve terapötik olarak ilgili reaktifler 1,2,3,4 üretmek için geliştirilmiştir. Tek hücreli çalışmalar, hematopoez5 sırasında üretilen hücre tipleri de dahil olmak üzere iPSC tabanlı gelişimsel biyolojiyi araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hücre alt popülasyonları6 arasındaki ilişkileri çıkaramayan toplu RNA dizilimi ile karşılaştırıldığında, tek hücreli modaliteler, hücre heterojenliğinin değerlendirilmesine izin verir ve hücre gelişiminin tanımlanmasını ve karakterizasyonunukolaylaştırabilir 6,7.
iPSC’lerden hematopoietik hücrelerin oluşumu, heojenik endotel hücreleri oluşturmak için ilkel çizgi, mezoderm ve endotel durumları boyunca sıralı farklılaşma gerektirir. Heojenik endotel hücreleri, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin doğrudan öncüleridir8. Bu hücre tipleri oldukça farklı morfolojik ve hücresel özelliklere sahiptir. İn vitro türevli hematopoietik hücre modellerinin epigenetik manzarası ve gelişimsel dinamikleri hakkında sınırlı bir anlayış vardır, ancak bu, iPSC sisteminin tam terapötik potansiyelini ortaya çıkarmak için gerekli bir bilgidir. Çoğu durumda, yalnızca tek hücre analiz yöntemleri, hücre popülasyonlarının, transkripsiyonel aktivitelerin, kromatin manzaralarının ve heterojen hücre preparatları arasındaki gelişimi yöneten düzenleyici mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.
Tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNAseq) olmak üzere iki metodoloji, bireysel hücre düzeyindetranskripsiyonel içgörüleri ortaya çıkarabilir 9. Veri geçerliliğini ve güvenilirliğini belirleyen temel faktörlerden biri, katı kalite kriterlerini karşılayan numunelere duyulan tavizsiz ihtiyaçtır. Bunlar, hücre/nükleer yoğunluk, optimum canlılık ve minimum topaklanma için kesin gereksinimleri içerir. Tek çekirdeklerin hazırlanması teknik olarak zor olabilir. Daha önce dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımıyla ilgili ek zorluklar olabilir.
Standart scRNAseq yaklaşımlarında dört önemli potansiyel sınırlamaya dikkat çekiyoruz. İlk olarak, hücre süspansiyonları oluşturmak için standart protokoller, kriyoprezervasyon sonrası alınanlardan ziyade genellikle taze hücrelerden veya dokulardan elde edilen preparatlara atıfta bulunur10. Bu, potansiyel olarak değerli kaynakların kullanımını kısıtlayabilir. İkincisi, çeşitli hücre tiplerinin ayrışma etkinliği değişkendir. Örneğin, birçok bağışıklık hücresi tipi göreceli olarak kolaylıkla ayrışır. Buna karşılık, normalde hücre dışı matriks ve bazal membrana gömülü olan stromal hücreler, fibroblastlar ve endotel hücreleri, çekirdek izolasyonunu karmaşıklaştırabilen benzersiz hücre özelliklerine sahiptir11,12. Bu özellikler, daha hassas hücre popülasyonlarının yapısal bütünlüğünü tehlikeye atabilecek agresif ayrışma protokolleri gerektirebilir. Üçüncüsü, bazı hücreler (örneğin megakaryositler) çapı 100 μm’yi aşabilir ve mevcut birkaç ticari tek hücreli platform için zorluklar yaratabilir13. Ek olarak, yanlış kullanım, enzimatik hidroliz ve mekanik ayrışmayı içeren hücre izolasyonunun ilk adımları sırasında hücresel hasara ve stres tepkilerine yol açabilir ve bu da gen ekspresyon profillerinietkileyebilir 11,14.
Bu ve diğer nedenlerden dolayı, tek hücre yöntemlerine göre tek çekirdekli bir yaklaşım tercih edilebilir bir alternatif olabilir15. Nükleer zarın hücre zarına kıyasla üstün stabilitesi göz önüne alındığında, nükleer zarf, doku kriyoprezervasyonundan sonra bile bozulmadan kalabilir16. Bu, nükleer ekstraksiyonu kolaylaştırabilir ve yeni nesil dizileme modaliteleri için uygun numune türlerinin çeşitliliğini artırabilir. İkincisi, çekirdekler mekanik bozulmalara karşı yüksek direnç sergiler ve ayrışma sırasında daha az transkripsiyonel kayma gösterme eğilimindedir14. Bu nedenle, çekirdekler daha fazla RNA stabilitesi ve daha tekrarlanabilir transkripsiyonel profiller sağlayabilir. Tek çekirdekli yöntemlerin dikkate değer üçüncü bir avantajı, hücre boyutu kısıtlamalarının olmaması ve kardiyomiyositler veya megakaryositler gibi daha büyük hücreler için uygulanabilirliğidir12. Dördüncüsü, çekirdekler, gen ekspresyonu, erişilebilir kromatin bölgeleri ve diğer parametrelerin17 entegre analizinden genişletilmiş içgörüler sunan multiomik analizler için uygun substratlar olarak hizmet eder ve hücre heterojenliği, gelişimi ve fonksiyonel durumlarının daha derin anlaşılmasını sağlar18.
Multiomik yaklaşımlar, hematopoietik gelişim sırasında iPSC’lerin profilini çıkararak, normal veya patolojik hastalık modellerinde gelişimsel süreçleri tanımlamaya yardımcı olabilir. iPSC’den türetilen hücrelerin birincil hücreler veya dokularla karşılaştırılması, iPSC modelinin in vivo biyolojiye uygunluğunun bir değerlendirmesini sağlayabilir, iPSC modelinin iyileştirilmesini ve yeni hücre popülasyonlarının ve kan oluşumunu yönlendiren faktörlerin keşfedilmesini kolaylaştırabilir.
Her ne kadar birçok grup nükleer izolasyon ve bunun sonucunda ortaya çıkan yeni nesil dizileme analizinde başarılı bir şekilde gezinmiş olsa da, yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek, tek çekirdek tabanlı analizler yapmakla ilgilenen bazı laboratuvarların önünde bir engel olmaya devam etmektedir. Bu el yazması, daha önce dondurularak rezerve edilmiş iPSC’den türetilmiş hücrelerden kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokolü detaylandırmaktadır. Yapışık stromal/endotelyal hücrelere ve yapışık olmayan hematopoietik progenitör hücrelere odaklandık, çünkü bunlar, yeni nesil dizileme veya diğer deneyler için uygun olan yüksek kaliteli çekirdeklerin geri kazanımını artırmak için özel modifikasyonlar ve sorun giderme gerektiren yapı ve içerik açısından çok farklı hücre tiplerini temsil eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol içindeki kritik adımlar
Yüksek kaliteli çekirdeklerin izole edilmesi, hızla gelişen mevcut tek çekirdek tabanlı yeni nesil dizileme modalitelerinin başarılı bir şekilde uygulanması için esastır. Bu yaklaşımlarla, özellikle de dondurularak korunmuş örneklerle ilgilenen laboratuvarlar için mevcut engelleri göz önünde bulundurarak, niyetimiz daha önce donmuş hücreler için özel olarak tasarlanmış bir nükleer izolasyon tekniği oluşturmaktı. Dondurularak saklanmı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, rehberlik ve önerileri için Jason Hatakeyama’ya (10x Genomik) ve Diana Slater’a (Philadelphia Uygulamalı Genomik Merkezi Çocuk Hastanesi) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (CST’ye HL156052) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Dimethyl sulfoxide solution (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent stem cells | N/A | N/A | The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| Dead Cell Removal Reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube. |
| Materials | |||
| 10 µl Micropipette | Wards science | 470231606 | |
| 100 µl Micropipette | Wards science | 470231598 | |
| 1000 µl Extended Universal Tip | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µl Micropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2.0 ml Cryogenic vials | Corning | 431386 | |
| 20 µl Micropipette | Wards science | 470231608 | |
| 200 µl Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station | Corning | 4144 | |
| Counting chamber | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1°C Freezing Container | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei Isolation Reagents | Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer, Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Dead Cell Removal kit | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385 | |
| Nuclease-Free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase inhibitor | Sigma | 3335399001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Other equipment | |||
| Automated cell counter | CytoSMART | 699910591 | |
| Microscope | Zeiss | Primostar 3 |
References
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131 (2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132 (2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer’s Res Ther. 11 (1), 71 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648 (2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337 (2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
