该协议描述了如何从已故器官供体中生成人类胰腺切片,以在近生理条件下研究细胞功能。这种创新方法能够研究正常和结构受损的胰岛,以及内分泌和外分泌区室之间错综复杂的相互作用。
研究人类胰腺对于了解与 1 型 (T1D) 和 2 型糖尿病 (T2D) 相关的病理生理机制以及胰腺内分泌和外分泌生理学和相互作用至关重要。从对分离胰岛的研究中已经学到了很多知识,但这妨碍了在整个组织的背景下检查它们的功能和相互作用。胰腺切片提供了一个独特的机会,可以探索正常、发炎和结构受损胰岛在其原生环境中的生理学,从而可以研究内分泌和外分泌区室之间的相互作用,以更好地研究胰腺组织的复杂动力学。因此,活体胰腺切片平台的采用代表了该领域的重大进步。该协议描述了如何通过组织包埋在琼脂糖和振动切片机中从已故器官供体中产生活组织切片,以及它们用于评估功能读数,如动态分泌和活细胞成像。
胰岛生理学研究对于理解糖尿病的发病机制和开发新的治疗方法至关重要。到目前为止,研究依赖于孤立的胰岛,这使胰岛暴露于机械和酶应激下,可能导致细胞生理学的变化;此外,不可能在其自然组织环境中评估胰岛功能,这可能受到外分泌细胞和血管细胞等的影响1。在研究 T1D 供体的胰腺时,存在一个挑战,即它们的胰岛难以分离,并且在分离过程中可能会变得支离破碎,这可能会对可能不代表体内群体的胰岛产生选择效应 2.此外,胰岛将与其复杂的环境和细胞连接分离,尤其是与在发炎胰岛中发现的浸润免疫细胞分离,这些免疫细胞在胰岛外围更丰富。因此,虽然分离的胰岛是糖尿病研究的基石工具,但也存在局限性。作为回应,我们引入了一种用于生成活体胰腺切片的突破性协议,为这些挑战提供了解决方案。
胰腺组织切片技术的最新发展和采用被认为是我们探索胰腺复杂生物学和功能能力的突破。这项创新为胰岛生理学的动态研究以及内分泌细胞、外分泌细胞、神经细胞、血管细胞和免疫细胞在其自然解剖背景下的相互作用开辟了新的途径。与传统方法不同,这种体外设置保留了器官的大部分细胞结构,从而更接近其天然生物学。该方法最初由 Speier 和 Rupnik 于 2003 年在小鼠中开发3,已证明其可用于评估钙成像、电生理学和细胞内和细胞间信号传导的激素分泌 4,5,6,7,8,9。然后将胰腺切片平台应用于通过手术活检获得的人胰腺组织的研究 4,10,11,12。我们小组通过糖尿病胰腺器官捐献者网络 (nPOD) 的活动证明了从尸体器官捐献者那里获得和利用胰腺切片的可行性13。nPOD 为进行人类 1 型糖尿病研究的经批准的研究人员提供胰腺组织,并且由于采用胰腺切片平台,nPOD 通常生成和分发活的胰腺切片 14,15,16,17。自 2020 年胰腺切片平台实施以来,nPOD 已成功将 43 名供体(包括 12 名 T1D 供体)的组织切片分发给众多研究者。利用这些切片,研究人员对胰岛功能的关键方面进行了开创性的研究,并探索了胰岛与脉管系统、神经系统和免疫细胞在 T1D 背景下的相互作用 13,18,19,20,21,22,23,24.许多研究强调了传统方法的局限性,并强调了可以捕捉胰腺内动态相互作用的技术的重要性 25,26,27。从小鼠到人类胰腺的切片技术的适应性,加上它们与糖尿病胰腺器官捐献者网络(nPOD)等项目的整合,证明了人们越来越认识到该方法在解锁对1型糖尿病等疾病的宝贵见解的潜力。
在这里,我们提出了一种方案来生成可行的胰腺组织切片及其用于功能性读数,如动态激素分泌和功能成像。与人胰岛分离类似,切片程序的成功受多种因素的影响,包括供体特性、组织运输时间和组织质量25,29。因此,仔细选择用于实验的组织样本并将缺血时间保持在最低限度至关重要。在这种情况下,除了尸体捐献者之外,还应仔细考虑其他可能的人体组织来源。包括手术供体提供了将功能性切片数据与来自同一患者的相关体内信息相结合的选项,从而增强了转化相关性11。然而,这种组织来源带来了其他因素,因为活检通常来自接受胰腺切除术的老年患者,主要是由于局部肿瘤。值得注意的是,胰腺活检不是在糖尿病的情况下进行的。
在执行实际切片程序时,及时的组织处理至关重要。切片可以储存数小时,如本协议所述,或如Qadir等人19所述长时间培养。目前,该协议是长时间维持切片活力的唯一方法,然而,未来的努力应评估不同培养时期的功能变化,并与来自同一供体的分离胰岛进行比较。
该过程中最关键的步骤是在包埋琼脂糖之前仔细进行组织制备。大的导管和纤维化组织会使切片过程复杂化,并可能导致组织块从琼脂糖中脱落。如果发生这种情况并且碎片保持合理的尺寸,则可以对它们进行重新加工和嵌入以进行切片。保持良好的组织质量和精心处理可以大大提高切片程序的效率,并产生最大数量和质量的切片。从组织制备到切片生成所经过的时间不应超过 2-3 小时,因为较长的间隔会显着影响组织活力。
在切片围灌注过程中,一个简单而关键的步骤是对切片进行精确修剪,以确保与腔室完美贴合。这样可以对组织进行适当的沐浴和不间断的流动。一旦协议启动,就必须避免进一步操纵腔室,以防止激素释放中不必要的峰值。应准备足够的缓冲液,并且管道应到达溶液的底部,以防止空气吸入和腔室干涸。
对于钙成像,根据实验需求和设计,仔细选择感兴趣的区域非常重要。通过选择可减少光曝光或缩短总体方案时间的成像参数来最大限度地减少光漂白非常重要。与动态激素分泌一样,保持适当的溶液流动和加热设置至关重要,因为切片需要接近生理条件才能实现最佳功能(例如,37°C)。
胰腺组织切片有效地保持了胰腺的结构完整性,保留了其不同细胞类型之间的细胞间连接。因此,它们提供了一种处理孤立胰岛的替代方案,促进了对内分泌和外分泌功能及其相互作用的同时探索。为了评估各个细胞类型的相互作用,区分它们至关重要。事后染色是一种选择,但它在可用的荧光探针和定位精确细胞层的挑战方面存在局限性。因此,建议将细胞特异性刺激纳入方案中,以实现基于反应的细胞鉴别。为了区分小鼠或人类切片中的细胞类型,有效的刺激包括α细胞的肾上腺素21,30,δ细胞的生长素释放肽31,腺泡细胞的蔚蓝素5,32,导管细胞的胆汁酸33和血管细胞的去甲肾上腺素22。类似的刺激可用于测量分泌反应。影像学研究侧重于单个细胞,而分泌研究则分析集体反应。因此,包含足够数量的切片以检测所需的结果至关重要。最佳数量可能因细胞类型而异,三个切片证明对内分泌细胞足够了;但是,建议使用更多切片来确保可检测性,而不是冒着丢失有价值信息的风险。
与任何其他方法一样,组织切片具有局限性,在解释结果时应考虑这些局限性。针对特定细胞类型的刺激应用可能会对切片中的其他细胞类型产生影响,从而可能触发反馈循环。然而,这些对于研究也很重要,因此测量的反应可以更能代表生理反应。对于选择性细胞靶向,可以使用传统的 体外 方案。重要的是,腺泡细胞含有胰酶,可以分解蛋白质并消化组织切片,导致细胞在几个小时内降解。为了保持活力,当切片处于静态状态时,一致使用胰蛋白酶抑制剂是必不可少的,即使它们的应用可能会干扰用于标记目的的病毒的成功转移。
与胰岛分离相比,供体变异性和组织质量会影响所获得切片的数量和活力。切片后活力不足可能导致寿命短,并阻碍切片培养的能力。此外,供体之间的胰岛数量可能会有很大差异,因此在进行实验之前估计胰岛含量具有挑战性。因此,仔细选择供体接受标准并实施适当的标准化方法,例如分泌激素含量的百分比或倍数变化到基线的百分比至关重要。为了获得一致的结果,建议在实验前评估组织切片的活力。此外,建议在实验中加入相关的控制刺激(例如,KCl)。在单个细胞分析(例如成像)的情况下,可以根据细胞对这些控制刺激的反应对细胞进行预分选。尽管存在上述挑战,但切片为当前的研究方法提供了宝贵的增强。
所描述的方案可以用作几种应用的起点,并且可以操纵胰腺切片,并在各种刺激后检查反应。我们还将读者引导至大量利用小鼠或人类胰腺切片的研究,为那些计划实验的人提供了宝贵的见解。将来,有可能使用胰腺切片来研究潜在的疗法,或者可以对疾病机制进行建模。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是在糖尿病胰腺器官捐献者网络 (nPOD;RRID:SCR_014641),一个由JDRF支持的合作1型糖尿病研究项目(nPOD:5-SRA-2018-557-Q-R)和Leona M.&Harry B. Helmsley慈善信托基金(Grant#2018PG-T1D053,G-2108-04793)。所表达的内容和观点是作者的责任,并不一定反映nPOD的官方观点。与 nPOD 合作提供研究资源的器官采购组织 (OPO) 列在 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/。作者感谢捐赠者及其家人的宝贵贡献。这项工作得到了美国糖尿病协会 4-22-PDFPM (J.K.P.) 和 Leona M. 和 Harry B. Helmsley 慈善信托基金(拨款 2015-PG-T1D-052)的支持。
Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |