Granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında evre I oositlerin hızlı izolasyonu
Summary
Bu protokol, granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında temiz evre I oositlerin hızlı bir şekilde izole edilmesi için modifiye edilmiş bir prosedürü tanımlar ve böylece oosite özgü araştırmalar için uygun bir yöntem sağlar.
Abstract
Oosit gelişiminin incelenmesi, gelişimsel biyolojide önemli etkilere sahiptir. Zebra balığı (Danio rerio), oositten embriyoya kadar erken gelişimsel süreçleri araştırmak için model bir organizma olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Zebra balıklarında, oositler tek bir somatik granüloza hücresi tabakası ile çevrilidir. Bununla birlikte, granüloza hücrelerini oositlerden ayırmak bir zorluk teşkil eder, çünkü saf oositler elde etmek hassas analiz için çok önemlidir. Farklı gelişim aşamalarında zebra balığı oositlerini izole etmek için çeşitli yöntemler önerilmiş olsa da, mevcut teknikler granüloza hücrelerinin tamamen çıkarılmasında yetersiz kalmakta ve yalnızca oositlere odaklanan genom analizinin doğruluğunu sınırlamaktadır. Bu çalışmada, granüloza hücre kontaminasyonunu ortadan kaldırırken zebra balıklarında saf evre I oositleri izole etmek için hızlı ve verimli bir süreç geliştirdik. Bu teknik, özellikle oositlere özgü epigenetik ve genom yapısı yönlerinin araştırılmasında biyokimyasal ve moleküler analizleri kolaylaştırır. Özellikle, yöntem kullanıcı dostudur, oosit hasarını en aza indirir ve sonraki araştırma ve analizler için pratik bir çözüm sunar.
Introduction
Zebra balığı, gelişim biyolojisindeki en önemli model sistemler arasında yer alır. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, zebra balığını, oositten embriyoya kadar önemli biyolojik olayları ve düzenleyici süreçleri incelemek için bir model olarak kullanmıştır. Bunlar, oosit gelişimi ve olgunlaşması1, maternal genlerinişlevselliği 2, maternal-zigotik geçişlerindüzenlenmesi 3 ve kapsamlı omik analizler4’ün karmaşık süreçlerini kapsar.
Yumurtalık folikülü5,6 içinde gelişmekte olan oositi saran ve besleyen somatik hücreler olan granüloza hücreleri, bu gelişim sürecinde çok önemli bir rol oynar. İlkel germ hücreleri (PGC’ler) oogonyaya dönüştükçe, tek katmanlı bir granüloza hücresi ile çevrili hale gelirler7. Dış tekal hücrelerle birlikte, oosit ve çevresindeki granüloza hücreleri olgun bir folikül oluşturur8. Germ hücreleri ve somatik hücreler arasındaki temel ayrım göz önüne alındığında, özellikle genomla ilgili analizler için saf bir oosit örneği almak zorunludur.
Zebra balığının foliküler yapısı içinde, granüloza hücreleri tipik olarak sadece birkaç mikronluk bir çap sergiler8, bu da granüloza hücreleri ve oositler9 arasındaki yakın bağlantıyı vurgular. Bu yakın ilişki, granüloza hücrelerinin hem sayısı hem de hacmi ile oositler arasındaki önemli fark (tek bir oosite kıyasla yüzlerce granüloza hücresi) nedeniyle tam ayırmanın elde edilmesinde bir zorluk teşkil etmektedir10,11. Tek bir granüloza hücresi ile minimum kontaminasyon bile, özellikle oositleri hedef alan aşağı akış analizlerini engelleyebilir. Bu nedenle, genomik ve epigenetik özelliklere odaklanan çalışmalar için granüloza hücrelerinin eliminasyonu esastır.
İyi karakterize edilmiş morfolojik kriterlerden yararlanarak, her aşamadaki oositler çap11’e göre ayırt edilebilir. Zebra balığında oogenez süreci, morfoloji ve karyotip11’e göre beş aşamaya ayrılır. Evre I oositler (7-140 μm çapında), mayoz bölünmenin başlangıcından mayoz I’in erken aşamasına kadar oositleri kapsar. Evre II oositler (140-340 μm çapında) yavaş yavaş köpüklü ve yarı saydam hale gelir. Foliküllerin büyümesi ve kortikal alveollerin çoğalması ile merkezdeki germinal veziküllerin ayırt edilmesi zorlaşır12 (Şekil 1Aii). Evre III oositler (340-690 μm çapında) giderek vitellogenin biriktirir ve taze foliküller giderek opak hale gelir (Şekil 1Aiii). Mayoz, evre IV oositlerde (690-730 μm çapında) devam ederken, kromozomlar mayoz II’nin ortasına girer ve burada durgunlaşırlar (Şekil 1Aiv). Evre V oositler (730-750 μm çapında) olgunlaşmıştır ve yumurtlama için hazırdır 7,11 (Şekil 1Av).
Yukarıda belirtilen aşamaların her birinin benzersiz özelliklerine dayanarak, zebra balığı yumurtalıklarını kollajenaz I, kollajenaz II ve hyaluronidaz içeren bir sindirim çözeltisi kullanılarak sindirerek ve ardından belirli boyutlu bir hücre süzgecindensüzülerek oositleri aşama I’den III’e kadar izole etmek için bir yöntem önerilmiştir 13. Bununla birlikte, bu yöntem farklı gelişim aşamalarında oosit elde edilmesine izin verirken, oositleri ve granüloza hücrelerini tamamen ayırmada başarısız olur. Diğer araştırmacılar da granüloza hücrelerini oositlerden ayırmak için yöntemler önermişlerdir. Bununla birlikte, bu yöntemler öncelikle oosit hasarına neden olabilecek, zaman alıcı ve analiz için önemli sayıda oosit elde etmek için yetersiz olan mekanik yaklaşımlara dayanmaktadır14,15.
Mevcut yöntemlerin sınırlamaları ve özel araştırma gereksinimleri göz önüne alındığında, bu çalışma, oositleri ve granüloza hücrelerini tamamen ayırmak ve analiz için yeterli sayıda temiz evre I oosit elde etmek için bir prosedür oluşturmayı amaçlamaktadır. Atıfta bulunulan yöntem13’ü genişleterek, daha nazik olan ve oositlerin dağılmasını ve granüloza hücrelerinin ayrışmasını kolaylaştıran gelişmiş bir sindirim tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıyoruz. Daha sonra, oositler bir hücre süzgecinden geçirilir, ardından yıkama ve daha fazla mikroskobik seçim yapılır, bu da çok sayıda temiz evre I oositin elde edilmesini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, granüloza hücreleri hariç saf ve temiz evre I oositlerin aşağı akış analizi (özellikle genomik analizler) için izole edilmesi için bir yöntem geliştirdik. Bu modifiye edilmiş yöntem ile referans alınan yöntem13 karşılaştırıldığında, bu yöntem kullanılarak elde edilen evre I oositler morfolojik olarak sağlamdır, sayıca yeterlidir ve diğer somatik hücrelerle kontaminasyondan arındırılmıştır, bu da onları sonrak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32170813 ve 31871449) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Departmanı (2024NSFSC0651) ve mükemmellik disiplinleri için 1·3·5 projesi–Klinik Araştırma Fonu, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi (2024HXFH035) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu çalışmayla ilgili zebra balığı yetiştiriciliği için Pediatrik Cerrahi Laboratuvarı’ndan Zhao Wang ve Yanqiu Gao’ya teşekkür eder. Yazarlar ayrıca, incelemeye katılan tüm hakemlere ve bu makalenin hazırlanması sırasında İngilizce redaksiyon hizmetleri sağlayan MJEditor’a (www.mjeditor.com) teşekkür eder.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
References
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385 (2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390 (2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014 (2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907 (2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020)
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015)
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
