顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

ゼブラフィッシュは、発生生物学において最も重要なモデルシステムの1つです。近年、数多くの研究がゼブラフィッシュをモデルとして利用し、卵母細胞から胚までの重要な生物学的事象や調節過程を研究しています。これらには、卵子の発生と成熟¹、母体遺伝子の機能^性2、母体-接合子転換³の制御、および広範なオミクス解析⁴の複雑な過程が含まれます。

顆粒膜細胞は、卵巣卵胞^5,6内で発生中の卵子を包み育てる体細胞であり、この発生過程において極めて重要な役割を果たします。原始生殖細胞(PGC)が卵原細胞に進化すると、それらは顆粒膜細胞^の単層7に囲まれるようになる。外部髄膜細胞とともに、卵母細胞とその周囲の顆粒膜細胞は成熟した卵胞を構成する⁸。生殖細胞と体細胞の根本的な違いを考えると、特にゲノム関連の解析では、純粋な卵子サンプルを得ることが不可欠です。

ゼブラフィッシュの濾胞構造内では、顆粒膜細胞は通常、わずか数ミクロンの直径8^{を示し、顆}粒膜細胞と卵母細胞9との間の密接な相互接続を強調し^ている。この密接な関連は、顆粒膜細胞の数と体積の両方と卵子(単一の卵子と比較して数百の顆粒膜細胞)のかなりの違いのために、完全な分離を達成する上での課題を提示します^10,11。単一の顆粒膜細胞による最小限の汚染でさえ、特に卵子を標的とした下流の分析を妨げる可能性があります。したがって、ゲノムおよびエピジェネティックな特性に焦点を当てた研究では、顆粒膜細胞の排除が不可欠です。

十分に特徴付けられた形態学的基準の恩恵を受けて、各段階の卵子は直径¹¹に基づいて区別することができる。ゼブラフィッシュの卵形成過程は、形態学と核型¹¹によって5つの段階に分類されます。ステージIの卵子(直径7〜140μm)は、減数分裂の発症から減数分裂Iの初期段階までの卵子を包含しています。重要なことに、これらの卵子は透明であるため、透過光を通じて中心核を観察できます(図1Ai)。ステージIIの卵子(直径140-340μm)は、徐々に泡立ち、半透明になります。卵胞の肥大と皮質肺胞の増殖に伴い、中心の胚小胞を区別しにくくなる¹²(図1Aii)。ステージIIIの卵子(直径340〜690μm)は徐々にビテロゲニンを蓄積し、新鮮な卵胞はますます不透明になります(図1Aiii)。減数分裂は、染色体が減数分裂IIの中央に入り、そこで停滞するため、ステージIVの卵母細胞(直径690〜730μm)で継続します(図1Aiv)。ステージVの卵子(直径730〜750μm)は成熟し、排卵の準備ができています^7,11(図1Av)。

前述の各段階の特異な特性に基づいて、コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、およびヒアルロニダーゼを含む消化液を用いてゼブラフィッシュの卵巣を消化し、続いて特定のサイズの細胞ス^{トレーナー13}で濾過することにより、I期からIII期の卵母細胞を分離する方法が提案されている。しかし、この方法では、異なる発生段階で卵子を得ることができる一方で、卵子と顆粒膜細胞を完全に分離することはできません。他の研究者も、卵母細胞から顆粒膜細胞を分離する方法を提案しています。しかし、これらの方法は主に機械的なアプローチに依存しており、卵子の損傷を引き起こす可能性があり、時間がかかり、分析のためのかなりの数の卵子を得るには不十分である^14,15。

既存の方法の限界と特定の研究要件を考慮して、この研究は、卵子と顆粒膜細胞を完全に分離し、分析に十分な数のきれいなステージIの卵子を得る手順を確立することを目的としています。参照された方法¹³を拡張して、より穏やかで卵母細胞の分散と顆粒膜細胞の解離を容易にする改良された消化バッファー( 材料の表を参照)を採用しています。その後、卵子を細胞ストレーナーに通し、洗浄してさらに顕微鏡で選択することで、多数のクリーンなステージIの卵子を獲得することができます。