Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

As doenças diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos são um importante fardo global para a saúde. Em 2016, as doenças diarreicas foram responsáveis por 1,3 milhão de mortes no mundo e foram a quarta causa de morte em crianças menores de cinco anos ^1,2. O patógeno bacteriano entérico Gram-negativo Shigella é o agente causador da shiguelose, uma das principais causas de mortes diarreicas no mundo³. A shigelose causa morbidade e mortalidade significativas a cada ano em crianças de países de baixa e média renda ^4,5, enquanto infecções em países de alta renda estão ligadas a surtos de creches, alimentos e água ^6,7,8,9. O desenvolvimento ineficaz de^vacinas10 e o aumento das taxas de resistência antimicrobiana (RAM)^11,12 têm dificultado o manejo de surtos de Shigella em larga escala. Dados recentes do Centers for Disease Control and Prevention mostram que quase 46% das infecções por Shigella nos Estados Unidos apresentaram resistência aos medicamentos em 2020^13,14, enquanto a Organização Mundial da Saúde declarou a Shigella como um patógeno prioritário para a RAM, para o qual novas terapias são urgentemente necessárias¹⁵.

As infecções por Shigella são facilmente transmitidas pela via fecal-oral após a ingestão de água ou alimentos contaminados, ou através do contato humano direto. Shigella evoluiu para ser um patógeno eficiente, adaptado ao homem, com uma dose infecciosa de 10-100 bactérias suficiente para causar doença¹⁶. Durante o trânsito do intestino delgado, Shigella é exposta a sinais ambientais, como temperatura elevada e bile¹⁷. A detecção desses sinais induz alterações transcricionais para expressar fatores de virulência que aumentam a capacidade da bactéria de infectar o cólon humano 17,18,19. Shigella não invade o epitélio colônico a partir da superfície apical, mas transita através da camada epitelial após captação em células especializadas de microdobras apresentadoras de antígenos (células M) dentro do epitélio associado ao folículo 20,21,22. Após a transcitose, as células de Shigella são fagocitadas por macrófagos residentes. Shigella escapa rapidamente do fagossomo e desencadeia a morte celular de macrófagos, resultando na liberação de citocinas pró-inflamatórias ^5,23,24. Shigella então invade células epiteliais colônicas do lado basolateral, lisa o vacúolo macropinocítico e estabelece um nicho replicativo no citoplasma ^5,25. As citocinas pró-inflamatórias, particularmente a interleucina-8 (IL-8), recrutam leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) para o local da infecção, o que enfraquece as tight junctions epiteliais e permite a infiltração bacteriana do revestimento epitelial para exacerbar a infecção basolateral⁵. Os PMNs destroem o revestimento epitelial infectado para conter a infecção, o que resulta nos sintomas característicos da disenteria bacilar (sangrenta)⁵. Embora os mecanismos de invasão e replicação intracelular tenham sido completamente caracterizados, novas pesquisas estão demonstrando novos conceitos importantes na infecção por Shigella, incluindo regulação da virulência durante o trânsito gastrointestinal (GI)¹⁷, adesão¹⁹, melhor acesso basolateral através da permeabilidade da barreira²⁶ e carreamento assintomático em crianças desnutridas²⁷.

A capacidade de Shigella spp causar doença diarreica é restrita a humanos e primatas não humanos (PNH)²⁸. Modelos de infecção intestinal por Shigella foram desenvolvidos para zebrafish²⁹, camundongos³⁰, cobaias³¹, coelhos 21,32,33 e suínos^34,35. No entanto, nenhum desses sistemas-modelo pode replicar com precisão as características da doença observadas durante a infecção humana³⁶. Embora modelos de shigelose do NHP tenham sido estabelecidos para estudar a patogênese da Shigella, esses sistemas modelo são caros de implementar e requerem doses infecciosas artificialmente altas, até nove ordens de magnitude superiores à dose infecciosa em humanos 37,38,39,40,41,42. Assim, a notável adaptação de Shigella para infecção de hospedeiros humanos requer o uso de culturas de células derivadas de humanos para recriar modelos fisiologicamente relevantes para interrogação precisa da patogênese de Shigella.

Aqui, procedimentos detalhados são descritos para medir as taxas de aderência, invasão e replicação de Shigella dentro de células epiteliais colônicas HT-29. Usando esses protocolos padronizados, os mecanismos moleculares pelos quais os genes de virulência bacteriana e os sinais ambientais impactam cada etapa da infecção por Shigella podem ser interrogados para melhor entender a relação dinâmica de interação patógeno-hospedeiro.