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行为学

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Published: February 23, 2024
doi:
10.3791/66422
, ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,The Scripps Research Institute, 2Department of Molecular Medicine,The Scripps Research Institute, 3Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute

Summary

Este protocolo describe un ensayo para cuantificar la tasa de alimentación de Caenorhabditis elegans basado en la medición del aclaramiento de bacterias en cultivo líquido.

Abstract

La alimentación es un proceso biológico esencial para el crecimiento, la reproducción y la supervivencia de un organismo. Este ensayo tiene como objetivo medir la ingesta alimentaria de Caenorhabditis elegans (C. elegans), un parámetro importante a la hora de estudiar la genética del envejecimiento o el metabolismo. En la mayoría de las especies, la alimentación se determina midiendo la diferencia entre la cantidad de alimento proporcionada y la cantidad que queda después de un intervalo de tiempo determinado. El método presentado aquí utiliza la misma estrategia para determinar la alimentación de C. elegans. Mide la cantidad de bacterias, la fuente de alimento de C. elegans, eliminadas en 72 h. Este método utiliza placas de microtitulación de 96 pocillos y ha permitido el cribado de cientos de fármacos por su capacidad para modular la ingesta de alimentos a una velocidad y profundidad que no son posibles en otros modelos animales. La fortaleza de este ensayo es que permite medir la alimentación y la esperanza de vida simultáneamente y mide directamente la desaparición de alimentos y, por lo tanto, se basa en los mismos principios utilizados para otros organismos, lo que facilita la comparación entre especies.

Introduction

Caenorhabditis elegans se ha utilizado ampliamente en la investigación del envejecimiento.  Ha sido un modelo poderoso para estudiar la genética que subyace a la longevidad mediada por el metabolismo inducida por la restricción dietética, la reducción de la actividad mitocondrial o la reducción de la señalización de la insulina. 1,2,3,4,5,6,7. Sin embargo, se ha demostrado difícil medir la alimentación en el contexto de la longevidad para C. elegans debido al pequeño tamaño del animal 3,8,9,10,11,12,13,14,15.

La alimentación es un comportamiento biológico fundamental necesario para la supervivencia, y su estricta regulación se encuentra en el centro del mantenimiento de la salud metabólica, la reproducción y el envejecimiento. El comportamiento alimentario está controlado por múltiples vías de señalización tanto en el sistema nervioso como en la periferia y, por lo tanto, solo puede estudiarse in vivo 16,17,18,19. La alimentación representa el primero de tres pilares: (i) ingesta de energía, (ii) almacenamiento de energía y (iii) gasto energético que gobiernan la homeostasis energética de un organismo. La alimentación en C. elegans se ha investigado principalmente midiendo el bombeo faríngeo, definido por la tasa de contracciones de la faringe. Este enfoque ha proporcionado información crucial sobre el comportamiento alimentario de C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; Sin embargo, el bombeo faríngeo, especialmente medido en intervalos cortos de minutos, no se correlaciona necesariamente con la ingesta de alimentos.

La ingesta de alimentos no solo está determinada por la tasa de bombeo faríngeo, sino también por parámetros como la duración y la frecuencia de los episodios de alimentación y la densidad de bacterias alimentarias. Un animal puede tener un bombeo faríngeo muy alto, pero la duración de sus sesiones de alimentación puede ser más corta, lo que compensa el aumento de la tasa. Otro factor de confusión es la eficiencia con la que el bombeo puede o no ingerir y triturar bacterias. Un ejemplo extremo de desacoplamiento de la ingesta de alimentos del bombeo faríngeo es la adición de serotonina sin la presencia de ningún alimento (bacterias). En presencia de serotonina exógena, los animales bombean a una alta velocidad, pero sin bacterias presentes, la alta tasa de bombeo no conduce a la ingesta de alimentos 2,6,13,22,23.

El método de eliminación bacteriana presentado aquí mide la ingesta de alimento de las poblaciones de lombrices en pozos individuales a medida que disminuyen las concentraciones bacterianas con el tiempo (Figura 1). Este enfoque es similar a los utilizados en otras especies donde la desaparición del alimento representa una medida de la ingesta de alimento 10,11,24,25,26,27,28. En la publicación original, validamos este método de medición de la ingesta de alimentos alimentando a C. elegans con bacterias marcadas con isótopos 15N11. Las mediciones posteriores por espectrometría de masas mostraron que la medición de la desaparición de las bacterias se correlacionaba fuertemente con la aparición de marcaje de isótopos, revelando la absorción real de las bacterias en el animal11. Por lo tanto, estamos seguros de que el ensayo de depuración bacteriana representa la ingesta de alimentos en la mayoría de las circunstancias. El propósito del ensayo no es reemplazar el ensayo de bombeo faríngeo, sino agregar a la caja de herramientas de ensayos para estudiar la alimentación y el metabolismo en C. elegans y cómo se relaciona con el envejecimiento y la longevidad.

Protocol

Figura 1: Esquema del ensayo de aclaramiento bacteriano. Esquema gráfico de las principales secciones del protocolo (de arriba a abajo): Preparación de bacterias, sincronización de la población de lombrices, siembra en placas de 96 pocillos, esterilización de lombrices, adición de medicamentos, medición de OD600 el día 1 y el día 4. Una descripción detallada de estos pasos específicos se indica a la izquierda de cada representación. Abreviaturas: OD = densidad óptica; FUdR = fluorodesoxiuridina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 1. Preparación de bacterias NOTA: En esta sección se detalla la preparación de las bacterias de alimentación utilizadas en este ensayo. La cepa específica de E. coli utilizada en el ensayo se denomina OP50. OP50 es la cepa más utilizada para alimentar a C. elegans. La cepa OP50 utilizada es resistente a la carbenicilina/ampicilina, lo que evita la contaminación cruzada del cultivo de lombrices con otras bacterias9. Prepare el OP50 con 4-5 días de anticipación y radiografie la irradiación un día antes de su uso. Asegúrese de que todos los materiales que se encuentren con OP50 sean estériles29,30. Día -8: Miércoles (semana 1):Preparar el preinóculo inoculando 5 mL de LB con 100 μg/mL de ampicilina y 0,1 μg/mL de anfotericina B, y una sola colonia de OP50 e incubar durante aproximadamente 6 h a 37 °C en un agitador bacteriano. Inocular temprano para permitir un crecimiento suficiente para que el cultivo se vuelva turbio. Una vez que el cultivo esté turbio, diluir el cultivo de preinóculo de OP50 en 1:2.000 en 250 mL de TB que contenga 100 μg/mL de ampicilina. Incubar el cultivo durante la noche en un agitador de bacterias durante 17-19 h a 37 °C.NOTA: No se debe permitir que el cultivo crezca más de 19 h. Día -7: Jueves (semana 1)Después de la incubación de 17-19 h, transfiera el cultivo líquido OP50 a un tubo de centrifugación estéril y centrifugue durante 15 min a 3.100 × g en una centrífuga de mesa a 4 °C. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet OP50 con agua estéril y vuelva a centrifugar. Repite este lavado 2 veces. Después del segundo lavado, deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet OP50 en agua estéril hasta un volumen de 50 mL y transfiéralo a un tubo cónico prepesado de 50 mL. Granular la OP50 por centrifugación durante 20 min a 3.100 × g en una centrífuga de sobremesa a 4 °C. Después del tercer lavado, retire con cuidado todo el sobrenadante restante, asegurándose de que no quede agua en el tubo. Calcule el peso del pellet restando el peso del tubo de centrifugación vacío del peso del tubo de centrifugación con el pellet.NOTA: El peso de los gránulos suele oscilar entre 3 y 3,5 g. Vuelva a suspender completamente el gránulo OP50 en el tampón S-complete hasta una concentración de 100 mg/ml, asegurándose de que no queden grumos. Asegúrese de que la concentración de OP50 a 100 mg/mL corresponda a 2 × 1010 bacterias/mL. Si se conoce la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mL, determine espectrofotométricamente la concentración bacteriana por mL. Si es necesario, utilice el tampón S-complete para ajustar la concentración de la solución de alimentación OP50 a 2 × 1010 bacterias/ml. Pruebe el OP50 en una placa de agar para determinar si ha sido contaminado. Almacene el OP50 suspendido en un tampón S-complete a 4 °C. Día -3: Lunes (semana 2)Mata las bacterias a través de la irradiación de rayos X para evitar el crecimiento bacteriano durante el ensayo. 2. Preparación sincrónica del cultivo de lombrices NOTA: En esta sección se analiza la preparación de una población de gusanos sincrónicos. Todos los materiales que entran en contacto con las poblaciones de lombrices son estériles. Todas las placas se mantienen a 20 °C a menos que se indique lo contrario. Día -6: Viernes (semana 1), 16:00 h.Transfiera los animales a un plato nuevo.Tome una placa NGM en la que la mayor parte de la población de gusanos consiste en larvas L1 hambrientas.NOTA: Una población mixta también producirá resultados. El uso de gusanos L1 que han estado hambrientos durante mucho tiempo puede afectar el comportamiento alimentario en las generaciones actuales o futuras, ya que la inanición puede dejar marcas epigenéticas durante al menos tres generaciones. Lave las lombrices con no más de 1 ml de agua estéril. Alícuota ~300 μL de la población de gusanos lavada en placas NGM sembradas con OP50 concentrado (~300 mg/mL). Deje que las placas se sequen debajo de un secador de placas o un mechero Bunsen. Incubar las placas a 20°C hasta que gran parte de la población contenga adultos grávidos (lunes).NOTA: Este período de tiempo está optimizado para una población de gusanos N2 de tipo silvestre y puede variar de una cepa a otra. Los gusanos con retrasos en el desarrollo deben tenerse en cuenta y ser troceados antes y/o sembrados antes para que todas las cepas analizadas alcancen la edad adulta simultáneamente. Día -3: Lunes (semana 2) 10:00 a.m.Establecimiento de una población sincrónica¡CAUTELA! La lejía es corrosiva para la piel y los ojos. Su manipulación requiere guantes y gafas de seguridad.Recoja los gusanos lavándolos del plato con hasta 10 ml de agua estéril. Transfiera esta solución de gusano/agua a un tubo cónico de 15 ml. Lave los gusanos por gravedad, hundiéndolos en la mesa de trabajo durante aproximadamente 4 minutos (por el contrario, lávelos por centrifugación durante 2 minutos en una centrífuga de mesa a 310 × g. Deseche el sobrenadante por aspiración con una punta pequeña y agregue hasta 15 ml de agua estéril. Repite 3 veces. Retire el sobrenadante y agregue 5 mL de una solución de lejía/NaOH recién preparada (1,8 mL de lejía de uso doméstico, 0,5 mL de NaOH 10 N, 7,7 mL dedH2O). Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente o hasta que las lombrices se abran. Vórtice suavemente cada minuto durante al menos 10 s. Monitoree el progreso bajo el microscopio de disección.NOTA: El tiempo necesario para abrir los gusanos puede variar de una cepa a otra. Dejar los gusanos en la solución de lejía durante demasiado tiempo puede resultar en huevos no viables. Añadir tampón M9 para neutralizar la reacción una vez que todos los adultos se abran o se disuelvan (el volumen final debe ser de 15 mL) y centrifugar durante 2 min a 1.300 × g. Lavar los huevos 3 veces con 13 mL de tampón M9. Lavar los huevos una vez con 10 mL de tampón S-complete centrifugando durante 2 min a 1.300 × g. Aspire el sobrenadante, agregue 10 mL de S-complete y transfiera la suspensión a un tubo cónico nuevo de 15 mL. Gire suavemente el tubo a temperatura ambiente durante la noche en un nutator o dispositivo similar. Opcional: Si hay canales adultas después de la centrifugación final en tampón S-complete, filtre la solución de gusano a través de un filtro de células de 40 μm. Día -2: Martes (semana 2), 1:00 p.m.Sembrar los animales en platosCon un telescopio de disección, compruebe si los gusanos han eclosionado. Determine la concentración de gusanos en el tampón S-completo contando la población de gusanos en gotas de 10 μL utilizando un endoscopio de disección; Cuente de 5 a 10 gotas para cada muestra. Si la concentración de gusanos en cada gota de 10 μL supera los 30 gusanos por gota, diluya el stock total con S-complete a una densidad de gusanos por gota más baja para facilitar el recuento. Siembre la mezcla líquida de lombrices en cada pocillo de una placa de 96 pocillos a un volumen de 120 μL de la siguiente manera (concentraciones finales): 60 gusanos/mL en S-complete, 50 μg/mL de carbenicilina, 0,1 μg/mL de anfotericina y 6 mg/mL de OP50 preparado en la sección 1.NOTA: El volumen total a preparar depende del número de placas (~12 mL por placa de 96 pocillos). Debe haber de 6 a 12 gusanos en cada pozo. Alternativamente, se puede utilizar una citometría de flujo de partículas grandes, como la COPAS FP de Union Biometrica, para clasificar con precisión 10 gusanos en cada pocillo (consulte la sección sobre el efecto de aglomeración). Incluya también una mezcla líquida sin lombrices : 50 μg/mL de carbenicilina, 0,1 μg/mL de anfotericina y 6 mg/mL de OP50 preparado en la sección 1. Coloque 120 μL de la mezcla sin lombrices en la fila H de la placa de 96 pocillos, que se utiliza para determinar los valores de autolisis, como se mencionó anteriormente. Ponga 120 μL por pocillo de la mezcla con lombrices en las filas A-G.NOTA: Asegúrese de que los gusanos se mantengan en suspensión durante el pipeteo (consulte la Figura 2A, B). Utilizamos placas transparentes de 96 pocillos con un fondo plano. Nuestro diseño de placa divide la placa para producir 4 o 6 condiciones en las que cada par de columnas será un tratamiento farmacológico o una cepa de gusano diferente, y la fila inferior servirá como un control “sin gusanos” (Figura 2A, B). Para evitar la contaminación y la evaporación, selle la placa con un sellador de cinta. Incubar las placas durante aproximadamente 65 h a 20 °C hasta que los animales se conviertan en gusanos L4. Día 0: Jueves (semana 2) antes del mediodía.Esterilización de la población de lombrices mediante la adición de Fluorodesoxiuridina (FUdR).Añadir 30 μL de una solución madre FUdR de 0,6 mM para esterilizar a los animales en cada pocillo. Vuelva a sellar la placa con selladores de cinta y agite las placas durante 20 minutos en un agitador de placas de microtitulación a 800 rpm. Vuelva a colocar las placas en la incubadora a 20 °C.NOTA: En este paso, la concentración final de OP50 se reduce de 6 mg/mL a 5 mg/mL (1 × 109 bacterias/mL), y cada pocillo tiene un volumen final de 150 μL. Es crucial añadir FUdR a la etapa L4 antes de que los animales alcancen la edad adulta. Día 1: Viernes (semana 2)Añade drogas a la cultura.A las 9:00 a.m., confirme que la mayoría de los animales están grávidos y que cada pocillo contiene varios huevos. Si es necesario, agregue cualquier medicamento a la concentración deseada (consulte la discusión). Después de agregar el medicamento, selle las placas con sellador de cinta y agite las placas durante 20 minutos a 800 rpm en un agitador de placas.NOTA: La agitación asegura que todos los grumos bacterianos se disuelvan sin tocar el sellador. Tanto los grumos bacterianos como el líquido en el sellador distorsionarán la lectura de OD600 . Si hay gotas líquidas en el sellador, gírelo brevemente durante 10-20 s a 310 × g. Agitar de nuevo en la coctelera durante 5 min y medir. Después de 20 minutos de agitación en el agitador de placas de microtitulación, retire la tapa y el sello y mida el OD600 en un lector de placas; esta es la medición del Día 1 OD600 . Selle y devuelva las placas a una incubadora a 20 °C.NOTA: Debido a que las bacterias se asientan rápidamente, la lectura debe ocurrir dentro de los 10 minutos posteriores a agitar las placas. Use un microscopio invertido para revisar la población de gusanos en busca de signos de contaminación o toxicidad si se ha agregado un medicamento. Vuelva a colocar las placas en la incubadora a 20 °C. Día 4: Lunes (semana 3)Toma la lectura del Día 4 OD600 .Repita el procedimiento de lectura del día 1 (paso 2.5.1.3) para obtener el valor OD600 del día 4. Antes de la medición de OD600, agite las placas durante 20 minutos a 800 rpm en el agitador de placas de microtitulación. En un microscopio invertido, idealmente con un objetivo 2x, cuente la población de gusanos en cada pocillo y regístrela en una hoja de cálculo. Regrese las placas a la incubadora a 20 °C después de contar.NOTA: Vea una muestra de nuestra hoja de puntuación proporcionada en el Material Complementario. Después de la lectura del día 4 , las mediciones de la ingesta de alimentos están completas. Si es necesario, guarde estas placas para el análisis de la vida útil.NOTA: Este protocolo es compatible con Solis y Petrascheck31. 3. Análisis de los datos de ingesta de alimentos Figura 2: Diseño y análisis. (A, B) Posibles diseños de placas para condiciones 4 y 6 con los pozos de control “sin tornillo” en la fila H. Estos pozos son necesarios para determinar la tasa de autolisis. En cada placa, incluya siempre una población de control N2 no tratada como referencia. (C) Datos de muestra recogidos en la hoja de cálculo suministrada con el número de gusanos (recuadro verde), las dos medidas de OD600 en los días 1 y 4 (recuadros naranjas), los valores de autolisis (recuadro azul) y la evaluación utilizando la fórmula (2) ((OD600 -autolisis)/X0) en el recuadro rojo. El ejemplo específico que se muestra aquí utiliza el diseño de placa que se muestra en (B). Abreviaturas: OD = densidad óptica; X0 = número de gusanos por pocillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. NOTA: En esta sección se describe cómo se analizan los datos de ingesta de alimentos de la sección 2 de este protocolo. Los primeros valores que se calculan son los valores de control de la autolisis . Las bacterias se lisan con el tiempo en líquido, incluso en ausencia de gusanos. Este valor de autolisis también puede verse afectado por muchos productos químicos y debe controlarse, ya que es relativamente grande en comparación con la ingesta de alimentos de un gusano. Como se describe en el paso 2.3.1.4 y se muestra en la disposición de la placa en la Figura 2A, B, la fila H contiene la misma solución, excluyendo los tornillos sin fin. En nuestra configuración de placa que se muestra en la Figura 2B, hay 14 pozos por condición con dos pozos de control de autolisis respectivos (fila H, “sin gusanos”). Calcule los valores de control de autolisis para los pozos de control sin lombrices en cada condición utilizando la ecuación ( 1). Para cada grupo de pozos replicados, asegúrese de que haya al menos dos pozos de control sin gusanos , como se mencionó en el paso 2.3.1.4. Utilice la media de todos los pozos de control sin gusanos para el valor de autolisis de un grupo replicado.Selfysis = media(OD600 Día 1 – OD600 Día 4) (1)NOTA: Para la configuración de la placa que se muestra en la Figura 2B, calcularíamos seis valores de autolisis , uno para cada uno de los seis grupos, calculando la media de los dos pozos de control de electrólisis en la fila H. Calcule la ingesta de alimento por lombriz usando la ecuación     (2).NOTA: Fórmula utilizada en la hoja de cálculo (cuadro rojo, Figura 2C) donde X0 es el número de gusanos por pocillo. Después de determinar la ingesta de alimento por lombriz para cada pocillo, calcule los promedios y la desviación estándar para toda la condición.NOTA: Para la configuración de la placa que se muestra en la Figura 2B, 14 pocillos replicados por condición son suficientes para las comparaciones estadísticas. Normalice cada afección a su respectiva población de control N2 no tratada. Indique el cambio en la alimentación como un cambio de pliegue o porcentaje de alimentación N2.NOTA: La normalización se realiza porque los valores absolutos de OD600/X0 de la ecuación (2) pueden variar entre experimentos realizados en diferentes días.

Representative Results

Figura 3: Datos representativos. (A) El gráfico muestra las curvas dosis-respuesta del cambio de pliegue en la ingesta de alimentos en función de la concentración de serotonina. Todos los datos muestran una ingesta basal de alimentos no estimulada normalizada a una alimentación basal N2. Nótese que los animales daf-16(mu86) comen más que los animales de tipo salvaje N2 cuando no se les añadió serotonina, pero muestran un rango atenuado en su capacidad para controlar la alimentación. (B) El gráfico muestra un gráfico de violín del cambio de pliegue en la ingesta de alimentos de gusanos tratados con 50 μM del antipsicótico loxapina pero alimentados con bacterias muertas por rayos X, rayos γ o paraformaldehído (C) El gráfico muestra un gráfico de violín del cambio de pliegue en la ingesta de alimentos de diferentes mutantes con sus genotipos indicados en el eje x. Estos datos sugieren que los mutantes exc-4 y cgr-1 comen menos, mientras que los mutantes srp-6 comen más. Los asteriscos representan ** p < 0.001, ****p < 0.0001 según lo determinado por ANOVA y Brown-Forsythe-Welch, corregido post-hoc para tener en cuenta las pruebas de hipótesis múltiples. Las barras de error muestran ±S.E.M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La Figura 1 destaca el flujo de trabajo general de este protocolo. Ilustra todo el proceso, desde la creación de las bacterias hasta la adquisición de la lectura OD600 el día 1 y el día 4. Además, la infografía hace referencia a los pasos específicos de los métodos que se utilizan. La Figura 2A, B muestra dos posibles diseños de placas experimentales, incluyendo pozos de control “sin gusanos” en la fila H, necesarios para calcular las tasas de autolisis descritas en la sección de discusión. En la experiencia de nuestro laboratorio, es necesario que una de las condiciones sea el control de N2 sin tratar para tener en cuenta la variabilidad de la ingesta bacteriana de gusanos observada entre experimentos (ver discusión: Planificación [población de referencia N2]). La Figura 2C es un ejemplo de la hoja de cálculo utilizada para analizar los datos generados en este protocolo. Destaca el recuento de lombrices en verde, la selflisis en azul, el día 1 OD600 y el día 4 OD600 en naranja, y la ingesta de alimento por lombriz en rojo. Además, se realiza un seguimiento de cada pocillo para determinar la cepa, el fármaco, la concentración, la fecha del experimento y otros tratamientos añadidos. Se puede encontrar más información sobre las ecuaciones específicas utilizadas en la sección 3 del protocolo. En general, estas hojas de cálculo (plantilla proporcionada como materiales complementarios) proporcionan una recopilación y un análisis de datos eficientes de este protocolo. La Figura 3A muestra resultados representativos de una curva dosis-respuesta de cómo la serotonina modula la alimentación en mutantes N2 y daf-16 utilizando este protocolo. En este experimento, se calculó el cambio de pliegue de la ingesta basal de alimentos (primer punto de la curva) a través de cinco dosis crecientes de serotonina. Como destacan estos resultados, la cepa N2 es capaz de comer en exceso de forma dependiente de la dosis. Sin embargo, para el mutante daf-16(mu86), aunque la alimentación basal es mayor que la de N2, el mutante no puede responder a la serotonina de la misma manera dependiente de la dosis que la cepa N2. Este protocolo permite determinar el comportamiento alimentario entre dos cepas donde la concentración de serotonina fue el factor variable para generar curvas dosis-respuesta. La Figura 3B muestra la ingesta de alimentos de gusanos tratados con el antipsicótico loxapina pero alimentados con bacterias muertas por rayos X, rayos γ o paraformaldehído. Nótese que estos experimentos no se llevaron a cabo en paralelo y que las diferencias no son representativas de los diferentes métodos para matar las bacterias, sino que se deben a la variabilidad interexperimental. La Figura 3C muestra la ingesta de alimentos de una serie de cepas genéticas, con dos cepas que muestran una disminución y una cepa que muestra un aumento en el comportamiento alimentario en relación con N2. Esta aplicación del protocolo permite probar un fármaco a una concentración en diferentes antecedentes genéticos. Es adecuado para identificar antecedentes genéticos que muestran una respuesta de ingesta de alimentos diferente a la de los controles N2 de tipo salvaje cuando se les administra el mismo fármaco. Se puede combinar con nuestro protocolo de vida útil para controlar rápidamente la ingesta de alimentos y la vida útil en la misma configuración de plato31. Material complementario: Plantillas de hojas de cálculo que se muestran en la Figura 2C. Haga clic aquí para descargar estos materiales.

Discussion

El protocolo presentado mide la eliminación bacteriana como una lectura de la ingesta de alimentos de C. elegans en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las curvas dosis-respuesta en la sección de resultados representativos muestran que el ensayo mide cuantitativamente la ingesta de alimentos, una noción que se confirmó de forma independiente utilizando bacterias marcadas con isótopos11. Utilizando este ensayo, probamos con éxito medicamentos aprobados por la FDA, como los antipsicóticos, con efectos secundarios metabólicos humanos conocidos y demostramos que estos medicamentos aumentaron la alimentación en C. elegans10,26. El ensayo es útil para estudiar la genética o la farmacología de la alimentación y añade una nueva herramienta para la investigación de C. elegans para estudiar el metabolismo. Este ensayo proporciona un método de bajo costo para estudiar la alimentación de una manera escalable y amigable con el tiempo, lo que no es posible en la mayoría de los otros organismos. Nuestro trabajo sobre medicamentos aprobados por la FDA muestra que muchos efectos secundarios observados en pacientes humanos también se observan en C. elegans, lo que revela una conservación evolutiva 24,26,32.

El ensayo está limitado por la concentración de bacterias que se pueden medir dentro del rango lineal de la medición de OD600 . Como resultado, el número de gusanos y el rango de concentraciones bacterianas que se pueden analizar son limitados. Demasiados gusanos afectarán a OD600 al consumir las bacterias demasiado rápido, por lo tanto, “comerán” la concentración bacteriana de la ODlineal 600. En nuestra experiencia, la variabilidad en la preparación bacteriana es el parámetro crítico que hace que los resultados varíen de un experimento a otro. Hemos intentado sin éxito congelar grandes lotes de bacterias o utilizar bacterias liofilizadas. En estos casos, la tasa de autolisis se volvió demasiado alta o las bacterias eran de una calidad que ralentizaba el desarrollo de C. elegans . Sin embargo, nuestras pruebas no han sido exhaustivas y este problema puede tener solución.

En general, la tasa de autolisis de las bacterias es la más difícil de controlar y puede causar una variabilidad considerable. Descubrimos que algunos fármacos pueden aumentar la tasa de autolisis a niveles que el ensayo no pudo determinar de forma fiable la ingesta de alimentos. Debido a que la tasa de autolisis aumenta con el tiempo en el ensayo, no hemos medido la ingesta de alimentos más allá del día 5 de la edad adulta. A esa edad, las bacterias están ~ 10 días en cultivo. Para medir la ingesta de alimentos después del día 5 de la edad adulta, las bacterias viejas deben lavarse y reemplazarse por otras nuevas.

El ensayo presentado es una extensión de nuestro ensayo de vida útil basado en placas de microtitulación de 96 pocillos31. Esta combinación permite medir la esperanza de vida y la ingesta de alimentos en la misma población. Si bien el ensayo de depuración bacteriana presentado aquí no permite determinar la ingesta de alimentos durante toda la vida de C. elegans debido a la autolisis bacteriana, proporciona datos sólidos para los primeros cuatro días de la edad adulta, el momento con la mayor ingesta de alimentos. Especialmente para el descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas, es esencial controlar la ingesta de alimentos. En resumen, anticipamos que el ensayo presentado será útil para la comunidad de C. elegans y ampliará el conjunto de herramientas para estudiar el metabolismo o controlarlo en el contexto de los estudios de envejecimiento y esperanza de vida.

Planificación:

Antes de planificar la medición de la ingesta de alimentos, se deben hacer algunas consideraciones.

Matar las bacterias:

Eliminamos las bacterias por irradiación con rayos X en un tubo cónico de 50 mL (900 Gray durante 4 h ajustado a 160,0 kV y 25,0 mA). Utilizamos el RS2000 de Rad Source para la irradiación. Dependiendo del equipo, el tiempo específico y la dosis de radiación pueden variar de un centro a otro. La eliminación completa de las bacterias debe determinarse mediante la siembra de las bacterias después de la irradiación para detectar a los supervivientes por crecimiento. Es esencial matar todas las bacterias para evitar el crecimiento durante el ensayo, ya que esto causará una subestimación de la alimentación o incluso valores negativos de alimentación. Es importante destacar que las bacterias deben ser eliminadas para que C. elegans aún las coma. En nuestra experiencia, hay tres formas de matar grandes cantidades de bacterias de manera confiable: (i) irradiación por rayos X, (ii) por rayos γ y (iii) la adición de formaldehído29,30. Las tasas de autolisis entre estos tres métodos son comparables, con un coeficiente de variación del 8% entre las tasas de autolisis para los experimentos que se muestran en la Figura 3B. Los métodos que no funcionaron de manera confiable en nuestras manos fueron la irradiación UV, los cócteles de antibióticos, la inactivación por calor y la azida de sodio. Estos métodos no logran matar completamente las bacterias (UV y antibióticos), producen bacterias que C. elegans no come (calor) o cambian la ingesta de alimentos (azida de sodio).

Número de réplicas:

En nuestra experiencia, los cambios en el pliegue de la alimentación son generalmente pequeños en comparación con la variación observada. Por lo tanto, la medición de los cambios en la ingesta de alimentos requiere varios pozos replicados. La Figura 2A, B muestra placas de 96 pocillos diseñadas para cuatro o seis condiciones diferentes, con 21 o 14 pozos replicados y dos pozos de control de autolisis sin gusanos. Dada la gran variabilidad y los cambios relativamente pequeños que cabe esperar, los cambios de 0,5-2,5 veces en la alimentación tienden a ser los límites inferior y superior. Recomendamos de 14 a 21 pocillos de réplica para cada condición y al menos dos pocillos de control de autolisis, que se describen a continuación. Estas réplicas son suficientes para generar curvas cuantitativas dosis-respuesta para fármacos que cambian la alimentación11,26.

La autolisis controla:

OD600 mide el número de partículas en una solución, en su mayoría independiente del tamaño de las partículas. Sin embargo, las bacterias muertas se lisarán, perdiendo su naturaleza de partículas. A esto lo llamamos autolisis, que ocurre de forma independiente en presencia de gusanos y reduce las mediciones de OD600 sin que los gusanos coman. La autolisis ocurre durante el ensayo y debe medirse de forma independiente en al menos dos pocillos por condición. Estos pozos reciben el mismo tratamiento que los demás en la misma condición, excepto que no contienen lombrices. Descubrimos que muchos fármacos también pueden alterar la tasa de autolisis. Por lo tanto, cada condición necesita pozos de control de autolisis independientes con su respectiva concentración. La Figura 2 muestra una configuración de placa para cuatro o seis condiciones con todos los pozos de control de autolisis en la parte inferior de la placa en la fila H.

Población de referencia N2:

También observamos que la cantidad absoluta de bacterias consumidas puede fluctuar entre experimentos, muy probablemente en relación con la calidad de las bacterias. A pesar de nuestros mejores esfuerzos para prepararlos exactamente de la misma manera cada vez, hay fluctuaciones. Por ejemplo, las bacterias se pueden recolectar mientras se encuentran en un estado de división durante la fase de crecimiento logarítmico y, por lo tanto, ser mucho más grandes que las bacterias recolectadas en la fase estacionaria. Por lo tanto, estas simples diferencias en el tamaño de las bacterias pueden provocar cambios en el número de bacterias consumidas y diferentes valores de OD600 , ya que las mediciones de OD600 no distinguen entre tamaños. Por esta razón, siempre incluimos una población de animales control N2 no tratados que sirvan como valor de referencia, ya sea establecido en 1 o 100%, para determinar si los grupos experimentales comen más o menos que el control N2. Esta práctica permite comparaciones entre experimentos, incluso si los valores de OD600 varían.

Intervalos de tiempo:

El uso de valores de OD600 para medir la ingesta de alimentos requiere que la concentración bacteriana disminuya de manera medible. Debido a que el volumen de cultivo es mucho mayor que el de los gusanos, deben comer una cantidad significativa de bacterias para marcar una diferencia detectable. Permanecer en el rango lineal para los valores de OD600 requiere que la concentración bacteriana permanezca entre ~ 1 mg / mL y 10 mg / mL, de modo que una cantidad considerable de bacterias debe desaparecer para detectarla. Los gusanos comen más desde finales de L4 hasta el día 4 de la edad adulta debido a la producción de huevos. Por lo tanto, este intervalo es ideal. Los intervalos más cortos, como 24 h, se pueden medir11, pero eso es considerablemente más difícil y necesita ~ 40 pozos por condición. Otra opción para medir la ingesta de alimento de las larvas es duplicar el número de animales por pozo. Sin embargo, el problema con este enfoque es que demasiados gusanos comenzarán a afectar las lecturas de OD600 cuando crezcan.

Soluciones madre para medicamentos que se van a probar:

Si se prueba la capacidad de fármacos como la serotonina para modular la alimentación, tenga en cuenta lo siguiente al preparar soluciones madre. Por lo general, preparamos un stock de 50x para medicamentos solubles en agua y añadimos 3 μL a cada pocillo (1:50), pero otras concentraciones de stock (100x, 300x) también funcionan. Sin embargo, si los fármacos se diluyen en disolventes distintos del agua (por ejemplo, DMSO), la concentración final no debe superar el 0,5%. Los disolventes se vuelven rápidamente dañinos para C. elegan. Por lo tanto, las soluciones madre de medicamentos disueltos en solventes orgánicos como el DMSO deben ser 300x o más.

Puntuación de gusanos vivos y muertos:

La determinación de los animales vivos y muertos se basa en el movimiento del gusano. Se utiliza luz fuerte, especialmente luz azul, porque hace que los animales se muevan. Además, la puntuación del número de animales por pozo revelará si hay un exceso de muertes. El exceso de muertes puede ocurrir con sustancias tóxicas o altas concentraciones (>0.5%) de varios solventes, incluido el DMSO. Por lo general, debe haber menos de 1:100 (1%) animales muertos. Las placas se pueden agitar durante 30 s a 800 rpm en el agitador de placas de microtitulación si la comida se ha asentado y la población se vuelve difícil de contar. Ignore los pozos con machos o más de 16 gusanos (ver problemas).

Problemas potenciales:

Agitación inadecuada:

En un medio líquido, las bacterias pueden agruparse fácilmente y asentarse en el fondo de los pozos. En nuestra experiencia, agitar durante menos de 20 minutos puede no romper los grumos bacterianos y resuspenderlos, lo que provoca mediciones inexactas de OD600. Las mediciones de OD600 en presencia de grumos bacterianos subestimarán la concentración bacteriana. Los ajustes excesivos del agitador pueden hacer que el líquido se pegue al sellador. Una vez que se retira el sellador para la lectura de OD600, el líquido adherido al sellador dará como resultado una lectura de OD600 más baja. Si hay líquido en el sellador, gire rápidamente la placa a baja velocidad (500-1.000 rpm) y agite nuevamente durante 5 minutos. Además, asegúrese de leer dentro de los 10 minutos posteriores a la agitación de las placas para evitar que las bacterias se asienten.

Diferentes valores de ingesta absoluta de alimentos entre experimentos:

A pesar de nuestros mejores esfuerzos para estandarizar las preparaciones bacterianas, a menudo difieren en formas que afectan la ingesta de alimentos en los gusanos. Por ejemplo, debido a su estado de división, las bacterias difieren en tamaño en función de si se cosecharon en la fase de crecimiento logarítmico o estacionaria, siendo las bacterias logarítmicas más grandes. Debido a que las mediciones de DO600 no distinguen entre tamaños, las diferencias en el tamaño de las bacterias debidas a la fase en la que se cosechó la bacteria pueden dar lugar a las diferencias aparentes observadas en la ingesta basal de alimentos entre las preparaciones bacterianas. La mejor manera de comparar entre experimentos es incluir siempre una población de control N2 no tratada y normalizar los resultados a esta población N2.

Efectos de aglomeración:

La concentración bacteriana en este protocolo es suficiente para mantener el OD600 en el rango lineal para 2-16 gusanos por pocillo durante ~72 h. Dependiendo del fármaco de interés, un pocillo que contenga más de 16 gusanos puede agotar la concentración bacteriana antes de la segunda medición. También encontramos que los pozos con un animal tienden a ser poco confiables. El factor de lisis supera lo que come un solo gusano. Por lo tanto, errores menores en la determinación del factor de lisis afectan desproporcionadamente a los pozos con menos gusanos.

Recomendamos excluir los pozos de los análisis estadísticos si se cumple una de las siguientes condiciones. Hay machos en el pozo (no tenemos datos que comparen la ingesta de alimentos entre machos y hermafroditas); hay menos de 2 lombrices en el pozo o más de 16 lombrices en el pozo; los gusanos están muertos en la segunda lectura; o si hay descendencia en los pozos porque falló el FUdR. El FUdR es sensible al calor y se inactiva incluso a temperaturas tan bajas como 37 °C. Descongele siempre el FUdR en agua a temperatura ambiente.

Valores negativos de ingesta de alimentos:

Los valores de ingesta de alimentos son ocasionalmente negativos, lo que sugiere más comida en el día 4 que en el día 1. Los valores negativos de ingesta de alimentos pueden indicar uno de los siguientes factores: una alta tasa de autolisis , posiblemente causada por un fármaco añadido que actúa sobre las bacterias, o valores negativos de ingesta de alimentos, que pueden sugerir que el pozo está contaminado y que algo más que gusanos está creciendo. Las tasas de autolisis también aumentan a medida que las bacterias envejecen; Por lo tanto, recomendamos usar bacterias de no más de una semana de edad. Se ha añadido un fármaco que precipita con el tiempo, afectando al valor de OD600 . Un temblor insuficiente en el día 1 puede conducir a una lectura más baja de OD600 debido a los grumos bacterianos. Los gusanos sufrieron estrés hipóxico. Esto ocurre cuando la relación superficie-aire no es suficiente para permitir el intercambio de oxígeno. Utilice la placa específica de 96 pocillos en materiales y no exceda los 150 μL (120 μL + 30 μL de FUdR) por pocillo. La distancia entre la superficie del pozo y el fondo donde viven los gusanos determina la concentración de oxígeno.

Limitaciones:

Este ensayo se limita al cultivo líquido. Los comportamientos alimentarios observados en platos sólidos, como moverse dentro y fuera del césped, no se pueden evaluar con el ensayo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer a Xiaolan Ye, ya que este protocolo se desarrolló como resultado de una observación que hizo originalmente. Agradecemos a todos los miembros pasados y presentes del Laboratorio Petrascheck por su ayuda en el desarrollo y optimización de este protocolo. Este trabajo fue financiado por R21 AG080376 (a M.P.). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).

Materials

Amphotericin B RPI A40030-0.1 solvent: EtOH
Ampicillin Fisher Scientific BP176025 solvent: water
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 use to make NGM plates
Carbenicillin Fisher Scientific 46-100-RG solvent: water
Cell strainer Fisher Scientific 22363547 40 µm to remove adults
Cholesterol  MP Biomedicals 02101380-CF 5 mg/mL stock
Difco, Agar, Bacteriological BD Biosciences 214510 use to make NGM plates
Fluorodeoxyuridine Sigma Aldrich F0503 to sterilize worms on L4
Luria Broth RPI L24045-1000.0 open capsule, mix with 1 L of water, autoclave
M9 Buffer  Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358)
3 g KH2PO4 (FW: 136)
 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)
 autoclave
Microplate Sealer Fisher Scientific 236707
OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Plate 96-well  Falcon 351172
Plate reader Tecan 30016056 use 600 nm filter lens
Potassium Citrate, 1 M , pH 6 Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324)
26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210)
900 mL of dH2O
pH to 6 using 5 M KOH
autoclave 
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6  Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
136 g KH2PO4 (FW: 136)
900 mL dH2O
 pH to 6 using 5 M KOH
autoclave
S-Basal Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
5.9 g NaCl (FW: 58)
 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6)
add 900 mL dH2O
autoclave, cool to 55 °C
S-Complete Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT)
 10 mL of 1 M potassium citrate
 pH 6, 10 mL of trace metal solutions
 3 mL of 1 M CaCl2
3 mL of 1 M MgSO4
Serotonin hydrochloride Thermo Scientific AAB2126309 used at 5 mM
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653-5KG to make buffers and NGM plates
Terrific Broth Thermo Scientific J75856-A1 12.5 g in 250 mL of water, autoclave
Titer plate Shaker Thermo Scientific 88880023 shaken at 800 rpm, depends on shaker
Trace Metals Solution  Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24)
0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)
 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198)
0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)
 0.016 g CuSO4 (FW: 158)
autoclave
wrap in aluminum foil to keep in the dark
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References

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Clark, C., To, A., Petrascheck, M. Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance. J. Vis. Exp. (204), e66422, doi:10.3791/66422 (2024).
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