Summary

AQRNA-seq для количественного определения малых РНК

Published: February 02, 2024
doi:

Summary

Абсолютное количественное секвенирование РНК (AQRNA-seq) — это технология, разработанная для количественной оценки ландшафта всех малых РНК в биологических смесях. В данной работе продемонстрированы этапы подготовки библиотеки и обработки данных AQRNA-seq, количественно оценивающие изменения в пуле транспортной РНК (тРНК) в Mycobacterium bovis BCG во время периода покоя, вызванного голоданием.

Abstract

AQRNA-seq обеспечивает прямую линейную зависимость между количеством прочтений секвенирования и числом малых копий РНК в биологическом образце, что позволяет точно количественно оценить пул малых РНК. Описанная здесь процедура подготовки библиотеки AQRNA-seq включает в себя использование специально разработанных линкеров секвенирования и этап снижения модификаций метилирования РНК, которые блокируют процесс обратной транскрипции, что приводит к увеличению выхода полноразмерных кДНК. Кроме того, подробно описана реализация сопутствующего биоинформатического конвейера. Эта демонстрация AQRNA-seq была проведена путем количественного анализа 45 тРНК в Mycobacterium bovis BCG, собранных в течение 5 выбранных дней в течение 20-дневного курса депривации питательных веществ и 6 дней реанимации. Здесь также будут обсуждаться текущие усилия по повышению эффективности и строгости AQRNA-seq. Это включает в себя изучение методов предотвращения очистки геля для смягчения проблем с димерами праймера после амплификации ПЦР и увеличения доли полноразмерных прочтений для обеспечения более точного картирования считываний. Будущие усовершенствования AQRNA-seq будут сосредоточены на содействии автоматизации и высокопроизводительному внедрению этой технологии для количественного определения всех малых видов РНК в образцах клеток и тканей различных организмов.

Introduction

Секвенирование нового поколения (NGS), также известное как массово-параллельное секвенирование, представляет собой технологию секвенирования ДНК, которая включает в себя фрагментацию ДНК, лигирование адапторных олигонуклеотидов, амплификацию на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование ДНК и повторную сборку последовательностей фрагментов в геном. Адаптация NGS к секвенированной РНК (РНК-секвенирование) является мощным подходом к идентификации и количественному определению РНК-транскриптов и их вариантов1. Инновационные разработки в области подготовки библиотек РНК и биоинформатического анализа в сочетании с достижениями в области лабораторного оборудования расширили репертуар приложений РНК-секвенирования, перейдя от секвенирования экзома к передовым функциональным омикам, таким как профилирование некодирующих РНК2, анализ одиночных клеток3, пространственная транскриптомика 4,5, анализ альтернативного сплайсинга6, в том числе. Эти передовые методы РНК-секвенирования выявляют сложные функции РНК посредством количественного анализа транскриптома в нормальных и больных клетках и тканях.

Несмотря на эти достижения в области РНК-секвенирования, несколько ключевых технических особенностей ограничивают количественную мощность метода. В то время как большинство методов секвенирования РНК позволяют точно и точно количественно оценить изменения уровней РНК между экспериментальными переменными (т.е. биологическими образцами и/или физиологическими состояниями), они не могут обеспечить количественное сравнение уровней молекул РНК в образце. Например, большинство методов РНК-секвенирования не могут точно количественно определить относительное число копий отдельных молекул изоакцептора тРНК в клеточном пуле экспрессированных тРНК. Как подчеркивается в сопутствующей публикации7, это ограничение в отношении РНК-секвенирования обусловлено рядом особенностей структуры РНК и биохимии библиотечного приготовления. Например, активность ферментов лигирования, используемых для присоединения линкеров 3′- и 5′-концевого секвенирования к молекулам РНК, сильно зависит от идентичности концевых нуклеотидов РНК и линкеров секвенирования. Это приводит к значительным вариациям эффективности линкерных лигирования и значительному артефактному увеличению прочтений секвенирования 8,9,10.

Второй набор ограничений вытекает из присущих молекулам РНК структурных свойств. В частности, формирование вторичной структуры РНК и динамические изменения в десятках посттранскрипционных модификаций РНК эпитранскриптома могут вызывать спад полимеразы или мутацию во время обратной транскрипции. Эти ошибки приводят к неполному или усеченному синтезу кДНК или изменению последовательности РНК. Хотя оба эти явления могут быть использованы для картирования вторичных структур или некоторых модификаций, они снижают количественную точность RNA-seq, если на последующих этапах подготовки библиотеки не удается захватить усеченные кДНК или если обработка данных отбрасывает мутировавшие последовательности, не соответствующие эталонному набору данных. Кроме того, огромное химическое, длинное и структурное разнообразие РНК-транскриптов, а также отсутствие инструментов для равномерной фрагментации длинных РНК уменьшают применимость большинства методов РНК-секвенирования ко всем видам РНК13.

Метод AQRNA-seq (секвенирование РНК в абсолютном количестве) был разработан для устранения некоторых из этих технических и биологических ограничений, ограничивающих количественную точность. Сводя к минимуму зависящие от последовательности смещения при захвате, лигировании и амплификации во время подготовки библиотеки секвенирования РНК, AQRNA-seq достигает превосходной линейности по сравнению с другими методами, точно количественно определяя 75% референсной библиотеки из 963 микроРНК с 2-кратной точностью. Эта линейная корреляция между количеством прочтений секвенирования и распространенностью РНК также наблюдается при анализе пула стандартов олигонуклеотидов РНК переменной длины и в отношении ортогональных методов, таких как нортерн-блоттинг. Установление линейности между количеством прочтений секвенирования и обилием РНК позволяет AQRNA-seq достичь точной, абсолютной количественной оценки всех видов РНК в образце.

Ниже приведено описание протокола для рабочего процесса подготовки библиотеки AQRNA-seq и сопутствующего нисходящего конвейера анализа данных. Метод был применен для выяснения динамики численности тРНК во время состояния покоя, вызванного голоданием, и последующей реанимации в модели туберкулеза Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Были представлены результаты исследовательской визуализации данных секвенирования, а также последующего кластерного и дифференциального анализа экспрессии, которые выявили различимые закономерности в распространенности тРНК, связанные с различными фенотипами.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлена графическая иллюстрация процедур, связанных с подготовкой библиотеки AQRNA-seq. Подробную информацию о реагентах, химикатах и колонках/наборах, используемых в процедуре, можно найти в Таблице материалов. Рекомендуется проводи…

Representative Results

Mycobacterium bovis Штамм БЦЖ (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2, претерпевающий экспоненциальный рост, подвергался временным рядам (0, 4, 10 и 20 дней) питательного голодания с последующей 6-дневной реанимацией в богатой питательными веществами среде, как это было представлено ранее в Hu et al.7. М?…

Discussion

Рабочий процесс подготовки библиотеки AQRNA-seq предназначен для максимального захвата РНК в образце и минимизации падения полимеразы во время обратной транскрипции7. С помощью двухэтапного линкерного лигирования новые олигонотиды ДНК (Линкер 1 и Линкер 2) лигируются в избытк…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы настоящей работы выражают признательность авторам оригинальной статьи, описывающей технологию AQRNA-seq7. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) и Национального исследовательского фонда Сингапура через Альянс Сингапура-Массачусетского технологического института по исследованиям и технологиям устойчивости к противомикробным препаратам IRG.

Materials

2-ketoglutarate  Sigma-Aldrich 75890 Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2938C
5'-deadenylase (50 U/μL)  New England Biolabs M0331S (component #: M0331SVIAL) Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)  New England Biolabs M0437M (component #: N0437AVIAL) NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE AmericanBio AB00972-00500 Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F2262 Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis Agilent 5067-1548  The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)  New England Biolabs B9000 This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform  Macron Fine Chemicals 4441-10
Demethylase  ArrayStar AS-FS-004 Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L (component #: N0447LVIAL) This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block VWR Scientific Products 13259-052 Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
DyeEx 2.0 Spin Kit  Qiagen 63204  Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply Bio-Rad Labrotories PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL) Eppendorf 0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL) Eppendorf 022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL) Eppendorf 022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL) Eppendorf 022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure Sigma-Aldrich E7023  The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System Alpha Innotech FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS New England Biolabs N0556S (component #: B7025SVIAL) NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 840-309000 The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES Sigma-Aldrich H4034 Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)  VWR Scientific Products BDH3028  Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure Macron Fine Chemicals 3032-16 Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960 Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NEBuffer 2 (10X) New England Biolabs M0264L (component #: B7002SVIAL) NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Thermo Fisher Scientific AM9938 
Oligo Clean & Concentrator Kit  Zymo Research D4061  Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)  New England Biolabs M0437M (component #: B1004SVIAL) NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler MJ Research PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2  Thermo Fisher Scientific J62336 
PrimeScript Buffer (5X) TaKaRa 2680A 
PrimeScript Reverse Transcriptase TaKaRa 2680A 
QIAquick Gel Extraction Kit  Qiagen 28704 This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder New England Biolabs N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder New England Biolabs N0556S (component #: N0556SVIAL) NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)  New England Biolabs M0264L (component #: M0264LVIAL) NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)  New England Biolabs M0314L (component #: M0314LVIAL) Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase  TaKaRa 638509  TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)  TaKaRa 638509  TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)  New England Biolabs M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich  S5881 Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)  New England Biolabs M0202L (component #: M0202LVIAL) NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)  New England Biolabs M0202L (component #: B0202SVIAL) NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)  New England Biolabs M0437M (component #: M0437MVIAL) NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)  New England Biolabs M0437M (component #: B0216SVIAL) NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)

References

  1. Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
  2. Grillone, K., et al. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter.&#34. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117 (2020).
  3. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  4. Goh, J. J. L., et al. Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH. Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).
  5. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  6. Cummings, B. B., et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Sci Transl Med. 9 (386), 5209 (2017).
  7. Hu, J. F., et al. Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq. Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).
  8. Alon, S., et al. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).
  9. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10 (5), e0126049 (2015).
  10. Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number. Nuc Acids Res. 42 (22), e170 (2014).
  11. Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
  12. Li, F., et al. Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome. Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).
  13. García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data. PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939 (2022).
  14. . FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
  15. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  16. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  17. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2022).
  18. Ougland, R., et al. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation. Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).
  19. Bernhardt, H. S., Tate, W. P. Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH. Biol Direct. 7, 4 (2012).
  20. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  21. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chen, R., Yim, D., Dedon, P. C. AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs. J. Vis. Exp. (204), e66335, doi:10.3791/66335 (2024).

View Video