Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente
Summary
Descriviamo un metodo per studiare come il pH risponde ai segnali ambientali nei glicosomi della forma del flusso sanguigno dei tripanosomi africani. Questo approccio prevede l’utilizzo di un sensore di proteine ereditarie sensibile al pH in combinazione con la citometria a flusso per misurare la dinamica del pH, sia come saggio del corso temporale che in un formato di schermo ad alto rendimento.
Abstract
Il metabolismo del glucosio è fondamentale per il tripanosoma africano, Trypanosoma brucei, come processo metabolico essenziale e regolatore dello sviluppo del parassita. Poco si sa sulle risposte cellulari generate quando i livelli di glucosio ambientale cambiano. Sia nei parassiti del flusso sanguigno che in forma prociclica (stadio di insetto), i glicosomi ospitano la maggior parte della glicolisi. Questi organelli vengono rapidamente acidificati in risposta alla privazione di glucosio, che probabilmente si traduce nella regolazione allosterica degli enzimi glicolitici come l’esochinasi. Nel lavoro precedente, localizzare la sonda chimica utilizzata per effettuare misurazioni di pH era difficile, limitandone l’utilità in altre applicazioni.
Questo articolo descrive lo sviluppo e l’uso di parassiti che esprimono pHluorin2 glicosomialmente localizzato, un biosensore di pH proteico ereditabile. pHluorin2 è una variante raziometrica della pHluorin che mostra una diminuzione dell’eccitazione dipendente dal pH (acido) a 395 nm e contemporaneamente produce un aumento dell’eccitazione a 475 nm. I parassiti transgenici sono stati generati clonando il frame di lettura aperto di pHluorin2 nel vettore di espressione del tripanosoma pLEW100v5, consentendo l’espressione di proteine inducibili in entrambe le fasi del ciclo di vita. L’immunofluorescenza è stata utilizzata per confermare la localizzazione glicosale del biosensore pHluorin2, confrontando la localizzazione del biosensore con la proteina aldolasi glicosale residente. La risposta del sensore è stata calibrata a diversi livelli di pH incubando le cellule in una serie di tamponi che variavano in pH da 4 a 8, un approccio che abbiamo precedentemente utilizzato per calibrare un sensore di pH a base di fluoresceina. Abbiamo quindi misurato la fluorescenza di pHluorin2 a 405 nm e 488 nm utilizzando la citometria a flusso per determinare il pH glicosomiale. Abbiamo validato le prestazioni dei parassiti transgenici vivi che esprimono pHluorin2, monitorando il pH nel tempo in risposta alla deprivazione di glucosio, un noto fattore scatenante dell’acidificazione glicosale nei parassiti PF. Questo strumento ha una serie di potenziali applicazioni, tra cui il potenziale utilizzo nello screening dei farmaci ad alto rendimento. Oltre al pH glicosomiale, il sensore potrebbe essere adattato ad altri organelli o utilizzato in altri tripanosomatidi per comprendere la dinamica del pH nel contesto delle cellule vive.
Introduction
I cinetoplastidi parassiti, come la maggior parte degli organismi viventi, si basano sul glucosio come componente fondamentale del metabolismo centrale del carbonio. Questo gruppo comprende organismi importanti dal punto di vista medico, come il tripanosoma africano, Trypanosoma brucei; il tripanosoma americano, T. cruzi; e parassiti del genere Leishmania. Il metabolismo del glucosio è fondamentale per la crescita del parassita nelle fasi del ciclo di vita dei patogeni. Ad esempio, quando viene privato del glucosio, la forma del flusso sanguigno (BSF) del tripanosoma africano muore rapidamente. In particolare, la glicolisi funge da unica fonte di ATP durante questa fase dell’infezione1. Anche i parassiti della Leishmania dipendono dal glucosio nell’ospite umano, con la fase del ciclo di vita dell’amastigote che risiede nei macrofagi dell’ospite che dipendono da questa fonte di carbonio per la crescita2.
Sebbene questi parassiti abbiano stili di vita distinti che coinvolgono diversi insetti vettori, condividono molti punti in comune nel modo in cui rispondono e consumano il glucosio. Ad esempio, questi parassiti localizzano la maggior parte degli enzimi glicolitici in perossisomi modificati chiamati glicosomi. Questo organello specifico per i cinetoplastidi è correlato ai perossisomi dei mammiferi sulla base di meccanismi biosintetici e morfologiaconservati 3,4,5,6.
La compartimentazione della maggior parte degli enzimi della via glicolitica nel glicosoma offre mezzi di regolazione della via specifici del parassita. Utilizzando una sonda chimica di pH, abbiamo stabilito che la privazione di nutrienti innesca una rapida acidificazione dei glicosomi del parassita in forma prociclica (PF) che si traduce in un’alterazione dell’attività enzimatica glicolitica attraverso l’esposizione di un sito di legame del regolatore allosterico sull’enzima glicolitico chiave esochinasi 7,8. Nel nostro lavoro precedente, la sonda chimica richiedeva una consegna costante per l’uso, limitandone l’utilità in altre applicazioni. Inoltre, le difficoltà a mantenere la distribuzione della sonda nel glicosoma nel BSF hanno limitato l’utilità dell’approccio per lo studio del pH glisomiale in quella fase di vita.
In questo studio, abbiamo utilizzato il biosensore proteico fluorescente pHluorin2 per monitorare la variazione del pH glicosomico in BSF T. brucei in risposta a segnali ambientali, tra cui la fame di glucosio9 (Figura 1). I risultati di questo lavoro suggeriscono che BSF T. brucei acidifica rapidamente i glicosomi in risposta alla fame in modo reversibile, in modo simile alle risposte che abbiamo osservato nei parassiti PF. Ci aspettiamo che questo biosensore migliorerà la nostra comprensione della regolazione glicolitica in T. brucei e nei parassiti correlati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La percezione ambientale e i meccanismi di risposta nel tripanosoma africano sono poco compresi. È noto che i cambiamenti nella disponibilità di nutrienti innescano diverse risposte nel parassita, inclusa l’acidificazione dei glicosomi. Qui, abbiamo descritto un metodo per studiare la risposta del pH glicosomiale alle perturbazioni ambientali nelle cellule viventi utilizzando un sensore di proteine ereditabili, pHluorin2 e citometria a flusso.
Ci sono diversi passaggi critici nell’uso del se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 è stato clonato in pLEW100v5 da Twist Bioscience che ha fornito il costrutto in un vettore di clonazione ad alta copia; pLEW100v5 è stato un regalo del Dr. George Cross. L’antisiero contro l’aldolasi di T. brucei è disponibile presso la Dott.ssa Meredith T. Morris, Clemson University, su richiesta. Il lavoro dei laboratori JCM e KAC è stato parzialmente supportato da un premio del National Institutes of Health (R01AI156382). SSP è stato supportato da NIH 3R01AI156382.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
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