Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei
Summary
We beschrijven een methode om te bestuderen hoe pH reageert op omgevingssignalen in de glycosomen van de bloedbaanvorm van Afrikaanse trypanosomen. Deze aanpak omvat een pH-gevoelige erfelijke eiwitsensor in combinatie met flowcytometrie om de pH-dynamiek te meten, zowel als een tijdverlooptest als in een high-throughput screen-formaat.
Abstract
Het glucosemetabolisme is van cruciaal belang voor de Afrikaanse trypanosoom, Trypanosoma brucei, als een essentieel metabolisch proces en regulator van de ontwikkeling van parasieten. Er is weinig bekend over de cellulaire reacties die worden gegenereerd wanneer de glucosespiegels in de omgeving veranderen. Bij zowel bloedbaan- als procyclische parasieten (insectenstadium) herbergen glycosomen het grootste deel van de glycolyse. Deze organellen worden snel verzuurd als reactie op glucosedeprivatie, wat waarschijnlijk resulteert in de allosterische regulatie van glycolytische enzymen zoals hexokinase. In eerder werk was het lokaliseren van de chemische sonde die werd gebruikt om pH-metingen uit te voeren een uitdaging, waardoor het nut ervan in andere toepassingen werd beperkt.
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van parasieten die glycosomaal gelokaliseerd pHluorin2 tot expressie brengen, een erfelijke proteïne pH-biosensor. pHluorin2 is een ratiometrische pHluorin-variant die een pH-(zuur)-afhankelijke afname van de excitatie vertoont bij 395 nm en tegelijkertijd een toename van de excitatie oplevert bij 475 nm. Transgene parasieten werden gegenereerd door het open leesframe pHluorin2 te klonen in de trypanosoomexpressievector pLEW100v5, waardoor induceerbare eiwitexpressie in beide levenscyclusfasen mogelijk werd. Immunofluorescentie werd gebruikt om de glycosomale lokalisatie van de pHluorin2-biosensor te bevestigen, waarbij de lokalisatie van de biosensor werd vergeleken met het glycosomale residente eiwit aldolase. De reactiesnelheid van de sensor werd gekalibreerd bij verschillende pH-waarden door cellen te incuberen in een reeks buffers die in pH varieerden van 4 tot 8, een benadering die we eerder hebben gebruikt om een op fluoresceïne gebaseerde pH-sensor te kalibreren. Vervolgens hebben we pHluorin2-fluorescentie gemeten bij 405 nm en 488 nm met behulp van flowcytometrie om de glycosomale pH te bepalen. We valideerden de prestaties van de levende transgene parasieten die pHluorin2 tot expressie brachten, waarbij we de pH in de loop van de tijd volgden als reactie op glucosedeprivatie, een bekende trigger van glycosomale verzuring bij PF-parasieten. Deze tool heeft een reeks potentiële toepassingen, waaronder mogelijk worden gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen met een hoge doorvoer. Naast de glycosomale pH kan de sensor worden aangepast aan andere organellen of worden gebruikt in andere trypanosomatiden om de pH-dynamiek in de levende celomgeving te begrijpen.
Introduction
Parasitaire kinetoplastiden zijn, net als de meeste levende organismen, afhankelijk van glucose als een fundamenteel onderdeel van het centrale koolstofmetabolisme. Deze groep omvat medisch belangrijke organismen, zoals de Afrikaanse trypanosoom, Trypanosoma brucei; de Amerikaanse trypanosoom, T. cruzi; en parasieten van het geslacht Leishmania. Het glucosemetabolisme is van cruciaal belang voor de groei van parasieten in de pathogene levenscyclusstadia. Bij gebrek aan glucose sterft bijvoorbeeld de bloedbaanvorm (BSF) van het Afrikaanse trypanosoom snel af. Met name glycolyse dient als de enige bron van ATP tijdens dit stadium van infectie1. Leishmania-parasieten zijn eveneens afhankelijk van glucose in de menselijke gastheer, waarbij de levenscyclusfase van amastigote die zich in de macrofagen van de gastheer bevindt, afhankelijk is van deze koolstofbron voor groei2.
Hoewel deze parasieten verschillende levensstijlen hebben waarbij verschillende insectenvectoren betrokken zijn, hebben ze veel overeenkomsten in de manier waarop ze reageren op en glucose consumeren. Deze parasieten lokaliseren bijvoorbeeld de meeste glycolytische enzymen in gemodificeerde peroxisomen die glycosomen worden genoemd. Dit kinetoplastid-specifieke organel is verwant aan peroxisomen van zoogdieren op basis van geconserveerde biosynthetische mechanismen en morfologie 3,4,5,6.
De compartimentering van de meeste enzymen van de glycolytische route in het glycosoom biedt parasietspecifieke manieren om de route te reguleren. Met behulp van een chemische pH-sonde hebben we vastgesteld dat nutriëntendeprivatie een snelle verzuring van procyclische vorm (PF) parasietglycosomen veroorzaakt, wat resulteert in veranderde glycolytische enzymactiviteit door blootstelling van een allosterische regulatorbindingsplaats op het belangrijkste glycolytische enzym hexokinase 7,8. In ons vorige werk had de chemische sonde een constante toevoer nodig voor gebruik, waardoor het nut ervan in andere toepassingen werd beperkt. Bovendien beperkten uitdagingen om de sondeverdeling in het glycosoom in de BSF te handhaven het nut van de benadering voor het onderzoeken van de glycosomale pH in die levensfase.
In deze studie hebben we de fluorescerende eiwitbiosensor pHluorin2 gebruikt om de glycosomale pH-verandering in BSF T. brucei te volgen als reactie op omgevingssignalen, waaronder glucose-uithongering9 (Figuur 1). De resultaten van dit werk suggereren dat BSF T. brucei glycosomen snel verzuurt als reactie op uithongering op een omkeerbare manier, vergelijkbaar met reacties die we hebben waargenomen bij PF-parasieten. We verwachten dat deze biosensor ons begrip van glycolytische regulatie in T. brucei en verwante parasieten zal verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omgevingsperceptie en responsmechanismen in het Afrikaanse trypanosoom zijn slecht begrepen. Het is bekend dat veranderingen in de beschikbaarheid van voedingsstoffen verschillende reacties in de parasiet veroorzaken, waaronder verzuring van glycosomen. Hier hebben we een methode beschreven om de glycosomale pH-respons op omgevingsverstoringen in levende cellen te bestuderen met behulp van een erfelijke eiwitsensor, pHluorin2, en flowcytometrie.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 werd gekloond in pLEW100v5 door Twist Bioscience, die het construct leverde in een kloonvector met hoge kopieën; pLEW100v5 was een geschenk van Dr. George Cross. Antiserum tegen T. brucei aldolase is op aanvraag verkrijgbaar bij Dr. Meredith T. Morris, Clemson University. Het werk van de JCM- en KAC-laboratoria werd gedeeltelijk ondersteund door een prijs van de National Institutes of Health (R01AI156382). SSP werd ondersteund door NIH 3R01AI156382.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
- Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
- Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
- Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
- Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
- Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. 生物化学. 52 (21), 3629-3637 (2013).
- Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- . Restriction digest v.2 Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018)
- . Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3 Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021)
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
- Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
- Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. 遗传学. 171 (2), 517-526 (2005).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
- Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
- Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
- Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
- Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
- Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).
