Summary

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Methode, um zu untersuchen, wie der pH-Wert auf Umweltreize in den Glykosomen der Blutkreislaufform afrikanischer Trypanosomen reagiert. Dieser Ansatz beinhaltet einen pH-sensitiven Sensor für vererbbare Proteine in Kombination mit Durchflusszytometrie zur Messung der pH-Dynamik, sowohl als Zeitverlaufsassay als auch in einem Hochdurchsatz-Screen-Format.

Abstract

Der Glukosestoffwechsel ist für das afrikanische Trypanosom, Trypanosoma brucei, als essentieller Stoffwechselprozess und Regulator der Parasitenentwicklung von entscheidender Bedeutung. Über die zellulären Reaktionen, die entstehen, wenn sich der Glukosespiegel in der Umwelt ändert, ist wenig bekannt. Sowohl in Parasiten im Blutkreislauf als auch in prozyklischer Form (Insektenstadium) beherbergen Glykosomen den größten Teil der Glykolyse. Diese Organellen werden als Reaktion auf Glukoseentzug schnell angesäuert, was wahrscheinlich zu einer allosterischen Regulation von glykolytischen Enzymen wie Hexokinase führt. In früheren Arbeiten war die Lokalisierung der chemischen Sonde, die zur Durchführung von pH-Messungen verwendet wird, eine Herausforderung, was ihren Nutzen in anderen Anwendungen einschränkte.

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Verwendung von Parasiten, die glykosomal lokalisiertes pHluorin2, einen vererbbaren Protein-pH-Biosensor, exprimieren. pHluorin2 ist eine ratiometrische pHluorin-Variante, die eine pH-abhängige (säureabhängige) Abnahme der Anregung bei 395 nm zeigt, während sie gleichzeitig eine Zunahme der Anregung bei 475 nm ergibt. Transgene Parasiten wurden durch Klonierung des offenen pHluorin2-Leserahmens in den Trypanosomen-Expressionsvektor pLEW100v5 erzeugt, was eine induzierbare Proteinexpression in beiden Lebenszyklusstadien ermöglicht. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die glykosomale Lokalisation des pHluorin2-Biosensors zu bestätigen, indem die Lokalisation des Biosensors mit der glykosomalen residenten Proteinaldolase verglichen wurde. Die Reaktionsfähigkeit des Sensors wurde bei unterschiedlichen pH-Werten kalibriert, indem Zellen in einer Reihe von Puffern mit einem pH-Wert von 4 bis 8 inkubiert wurden, ein Ansatz, den wir zuvor zur Kalibrierung eines pH-Sensors auf Fluoresceinbasis verwendet haben. Anschließend maßen wir die pHluorin2-Fluoreszenz bei 405 nm und 488 nm mittels Durchflusszytometrie zur Bestimmung des glykosomalen pH-Werts. Wir validierten die Leistung der lebenden transgenen pHluorin2-exprimierenden Parasiten und überwachten den pH-Wert im Laufe der Zeit als Reaktion auf Glukoseentzug, einen bekannten Auslöser der glykosomalen Ansäuerung bei PF-Parasiten. Dieses Tool hat eine Reihe potenzieller Anwendungen, einschließlich des potenziellen Einsatzes im Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening. Über den glykosomalen pH-Wert hinaus könnte der Sensor an andere Organellen angepasst oder in anderen Trypanosomatiden verwendet werden, um die pH-Dynamik in der lebenden Zellumgebung zu verstehen.

Introduction

Parasitäre Kinetoplastiden sind wie die meisten lebenden Organismen auf Glukose als grundlegenden Bestandteil des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels angewiesen. Zu dieser Gruppe gehören medizinisch wichtige Organismen wie das afrikanische Trypanosom Trypanosoma brucei; das amerikanische Trypanosom, T. cruzi; und Parasiten der Gattung Leishmania. Der Glukosestoffwechsel ist entscheidend für das Wachstum von Parasiten in den pathogenen Lebenszyklusstadien. Wenn beispielsweise Glukose entzogen wird, stirbt die Blutbahnform (BSF) des afrikanischen Trypanosoms schnell ab. Insbesondere dient die Glykolyse als einzige ATP-Quelle in diesem Stadium der Infektion1. Leishmanienparasiten sind ebenfalls von Glukose im menschlichen Wirt abhängig, wobei das Amastigoten-Lebenszyklusstadium, das sich in Wirtsmakrophagen befindet, für das Wachstum auf diese Kohlenstoffquelle angewiesenist 2.

Während diese Parasiten unterschiedliche Lebensstile mit unterschiedlichen Insektenvektoren haben, haben sie viele Gemeinsamkeiten in der Art und Weise, wie sie auf Glukose reagieren und diese konsumieren. Zum Beispiel lokalisieren diese Parasiten die meisten glykolytischen Enzyme in modifizierten Peroxisomen, die Glykosomen genannt werden. Diese Kinetoplastid-spezifische Organelle ist mit Säugetier-Peroxisomen verwandt, basierend auf konservierten Biosynthesemechanismen und Morphologie 3,4,5,6.

Die Kompartimentierung der meisten Enzyme des glykolytischen Signalwegs in das Glykosom bietet parasitenspezifische Mittel zur Regulierung des Signalwegs. Mit Hilfe einer chemischen pH-Sonde konnten wir feststellen, dass Nährstoffentzug eine schnelle Ansäuerung von Parasitenglykosomen in prozyklischer Form (PF) auslöst, die zu einer veränderten glykolytischen Enzymaktivität führt, indem eine allosterische Regulatorbindungsstelle auf dem glykolytischen Schlüsselenzym Hexokinaseexponiert wird 7,8. In unseren früheren Arbeiten musste die chemische Sonde für den Einsatz ständig abgegeben werden, was ihren Nutzen in anderen Anwendungen einschränkte. Darüber hinaus schränkten Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Sondenverteilung im Glykosom im BSF den Nutzen des Ansatzes zur Untersuchung des glykosomalen pH-Werts in diesem Lebensstadium ein.

In dieser Studie haben wir den fluoreszierenden Protein-Biosensor pHluorin2 verwendet, um die glykosomale pH-Änderung in BSF T. brucei als Reaktion auf Umweltreize wie Glukosemangelzu überwachen 9 (Abbildung 1). Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass BSF T. brucei Glykosomen als Reaktion auf Hunger schnell reversibel ansäuert, ähnlich wie wir es bei PF-Parasiten beobachtet haben. Wir erwarten, dass dieser Biosensor unser Verständnis der glykolytischen Regulation in T. brucei und verwandten Parasiten verbessern wird.

Protocol

Die Verwendung von T. brucei brucei 90-13 BSF-Trypanosomen, einer monomorphen Parasitenlinie, erfordert eine Berücksichtigung der Sicherheit, da sie als Organismen der Risikogruppe 2 gelten, die in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 2 gehandhabt werden sollten. 1. Trypanosomenkultur und Transfektion Kultur T. brucei brucei 90-13 BSF-Trypanosomen in HMI-9-Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 10 % Nu-Serum bei 37 °C in 5 % CO…

Representative Results

pHLuorin2-PTS1-Lokalisierung an Glykosomen in BSF T. bruceiUm die subzelluläre Lokalisation des pHluorin2-PTS1 zu beurteilen, wurden die Parasiten Immunfluoreszenz-Assays unterzogen. Signal vom Transgen, das mit Antiseren kolokalisiert ist, die gegen ein Glykosomen-residentes Protein, Aldolase (TbAldolase), erhoben werden (Abbildung 2A). Der durchschnittliche Pearson-Korrelationskoeffizient der Kolokalisation zwischen Anti-TbAldolase und pHluorin2-PTS1 betrug 0…

Discussion

Die Umweltwahrnehmung und die Reaktionsmechanismen im afrikanischen Trypanosom sind kaum verstanden. Es ist bekannt, dass Veränderungen der Nährstoffverfügbarkeit verschiedene Reaktionen im Parasiten auslösen, einschließlich der Ansäuerung von Glykosomen. Hier haben wir eine Methode zur Untersuchung der glykosomalen pH-Reaktion auf Umweltstörungen in lebenden Zellen unter Verwendung eines vererbbaren Proteinsensors, pHluorin2, und Durchflusszytometrie beschrieben.

Bei der Verwendung des…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

pHluorin2-PTS1 wurde von Twist Bioscience, die das Konstrukt in einem High-Copy-Klonierungsvektor zur Verfügung stellten, in pLEW100v5 kloniert; pLEW100v5 war ein Geschenk von Dr. George Cross. Antiserum gegen T. brucei Aldolase ist auf Anfrage bei Dr. Meredith T. Morris, Clemson University, erhältlich. Die Arbeit der JCM- und KAC-Laboratorien wurde teilweise durch eine Auszeichnung der National Institutes of Health (R01AI156382) unterstützt. SSP wurde von NIH 3R01AI156382 unterstützt.

Materials

50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) VWR 10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) Corning 431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate BrandTech  781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit Lonza VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer invitrogen by Thermo Fisher Scientific A24858 FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate Millipore Sigma BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler invitrogen by Thermo Fisher Scientific A42973
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule Fisher Scientific 50-980-487
GraphPad Prism statistical software
Nigericin (sodium salt) Cayman Chemical 11437
Nucleofector 2b Lonza Discontinued Product
OP2 Liquid Handler opentrons OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O Sigma Life Science CAS:25988-63-0 Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3) biotium #40087 We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin Cayman Chemical 10009152 Pipetting robot for HTS assay
         For pH calibration
         For pH calibration

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Call, D., Pizarro, S. S., Tovey, E., Knight, E., Baumgardner, C., Christensen, K. A., Morris, J. C. Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (203), e66279, doi:10.3791/66279 (2024).

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