Ретиноевая кислота, инкапсулированная катионной наноэмульсией, в качестве адъюванта для стимулирования OVA-специфических системных и слизистых реакций
Summary
В этом протоколе мы разработали ретиноевую кислоту (РА), инкапсулированную катионной наноэмульсией, для использования в качестве адъюванта для стимулирования антиген-специфических системных и слизистых реакций. При добавлении одобренного FDA RA в наноэмульсию антиген-специфический sIgA стимулировался во влагалище и тонком кишечнике после внутримышечного введения наноэмульсии.
Abstract
Катионные наноструктуры появились как адъювант и система доставки антигенов, которая усиливает созревание дендритных клеток, генерацию АФК и поглощение антигена, а затем способствует антиген-специфическим иммунным реакциям. В последние годы все большее внимание уделяется ретиноевой кислоте (РА) из-за ее эффекта в активации иммунного ответа слизистой оболочки; однако для того, чтобы использовать РА в качестве вспомогательного средства слизистой, необходимо решить проблему его растворения, загрузки и доставки. Здесь мы описываем систему доставки катионной наноэмульсии, инкапсулированную ретиноевой кислотой (CNE-RA), состоящую из катионного липида 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ДОТАП), ретиноевой кислоты, сквалена в качестве масляной фазы, полисорбата 80 в качестве поверхностно-активного вещества и сорбитана триолеата 85 в качестве сопутствующего поверхностно-активного вещества. Его физико-химические свойства были охарактеризованы с помощью динамического рассеяния света и спектрофотометра. Иммунизация мышей смесью антигена (овальбумина, OVA) и CNE-RA значительно повысила уровни анти-OVA секреторного иммуноглобулина А (sIgA) в жидкости для промывания влагалища и жидкости для промывания тонкой кишки мышей по сравнению с одной OVA. В этом протоколе подробно описан метод получения, характеристики и оценки адъювантного эффекта CNE-RA.
Introduction
Адъюванты часто используются для повышения эффективности вакцины, стимулируя иммунную систему более сильно реагировать на вакцину, тем самым повышая иммунитет к определенному патогену1. Адъювант наноэмульсии (NE) относится к коллоидной дисперсионной системе с термодинамической стабильностью путем эмульгирования определенной доли масляной фазы и водной фазы с получением эмульсии в форме воды в масле (W/O) или масла в воде (O/W)2. Н/В наноэмульсионный адъювант может продуцировать цитокины и хемокины в месте инъекции, индуцировать быструю агрегацию и пролиферацию важных иммунных клеток, таких как моноциты, нейтрофилы и эозинофилы, а также усиливать иммунный ответ и улучшать иммуногенность антигенов3. В настоящее время три наноэмульсионных адъюванта (MF59, AS03 и AF03) лицензированы для использования в вакцинах и показали хорошую безопасность и эффективность4.
Тем не менее, иммунитет слизистой оболочки плохо решался с помощью лицензированных в настоящее время адъювантных препаратов в традиционной парентеральной вакцинации. Сообщалось, что ретиноевая кислота (РА) индуцирует кишечное хоуминг иммунных клеток, но ее низкая полярность, плохая растворимость в воде, а также плохая световая и термическая стабильность ограничивают ее использование для надежной кишечной вакцинации. Наноэмульсии открывают возможности для повышения биодоступности высоколипофильных препаратов, а масляная сердцевина эмульсионных адъювантов подходит для растворения неполярных веществ, таких как RA6. Таким образом, наноэмульсии могут быть использованы в качестве носителей РА с целью достижения двойного ответного эффекта системного иммунитета и иммунитета слизистой оболочки.
По сравнению с нейтральными или анионными системами доставки, катионные системы доставки обладают относительно эффективными возможностями инкапсуляции и доставки антигенов, что может повысить иммуногенность антигенов 7,8,9. Катионный поверхностный заряд различных адъювантных систем важен для их адъювантных эффектов 10,11,12. Катионный заряд является важным фактором в продлении удержания вакцины в месте инъекции, повышении презентации антигена и продлении стимуляции клеточного иммунитета в организме12.
Основываясь на вышеизложенных соображениях, мы разработали катионную наноэмульсию для эффективной совместной доставки РА и антигенов. Размер частиц и дзета-потенциал наноэмульсии определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS), а системные и слизистые иммунные реакции наноэмульсии в сочетании с OVA оценивали путем внутримышечной инъекции13.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы разработали катионную ретиноевую кислоту, инкапсулированную наноэмульсией, для использования в качестве адъюванта для стимулирования антиген-специфических системных и слизистых реакций. По сравнению с традиционными адъювантами NE он имеет следующие два преимущес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано ключевой программой Чунцинского фонда естественных наук (No cstc2020jcyj-zdxmX0027) и Китайским национальным фондом естественных наук (No 32270988).
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O’Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. Traversing the skin barrier with nano-emulsions. Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
