حمض الريتينويك المغلف بمستحلب النانو الموجبة كمساعد لتعزيز الاستجابات الجهازية والمخاطية الخاصة ب OVA
Summary
في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير حمض الريتينويك المغلف بمستحلب نانوي كاتيوني (RA) لاستخدامه كمساعد لتعزيز الاستجابات الجهازية والمخاطية الخاصة بالمستضد. من خلال إضافة التهاب المفاصل الروماتويدي المعتمد من إدارة الغذاء والدواء إلى المستحلب النانوي ، تم تعزيز sIgA الخاص بالمستضد في المهبل والأمعاء الدقيقة بعد الحقن العضلي للمستحلب النانوي.
Abstract
ظهرت الهياكل النانوية الكاتيونية كنظام توصيل مساعد ومستضد يعزز نضوج الخلايا المتغصنة ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية ، وامتصاص المستضد ، ثم يعزز الاستجابات المناعية الخاصة بالمستضد. في السنوات الأخيرة ، تلقى حمض الريتينويك (RA) اهتماما متزايدا بسبب تأثيره في تنشيط الاستجابة المناعية المخاطية. ومع ذلك ، من أجل استخدام RA كمساعد مخاطي ، من الضروري حل مشكلة حلها وتحميلها وتسليمها. هنا ، نصف نظام توصيل حمض الريتينويك المغلف بمستحلب النانو الموجبة (CNE-RA) المكون من الدهون الكاتيونية 1،2-ديوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوكولين (DOTAP) ، وحمض الريتينويك ، والسكوالين كمرحلة الزيت ، وبوليسوربات 80 كخافض للتوتر السطحي ، وثلاثي السوربيتان 85 كخافض للتوتر السطحي. تم تمييز خصائصه الفيزيائية والكيميائية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي ومقياس الطيف الضوئي. أدى تحصين الفئران بمزيج من المستضد (ovalbumin ، OVA) و CNE-RA إلى رفع مستويات الغلوبولين المناعي الإفرازي المضاد ل OVA A (sIgA) بشكل كبير في سائل غسل المهبل وسائل غسل الأمعاء الدقيقة للفئران مقارنة ب OVA وحده. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد وتوصيف وتقييم التأثير المساعد ل CNE-RA.
Introduction
غالبا ما تستخدم المواد المساعدة لتعزيز فعالية اللقاح عن طريق تحفيز الجهاز المناعي على الاستجابة بقوة أكبر للقاح ، وبالتالي زيادة المناعة ضد ممرض معين1. يشير المستحلب النانوي (NE) المساعد إلى نظام تشتت غروي مع استقرار ديناميكي حراري عن طريق استحلاب نسبة معينة من طور الزيت والطور المائي لإنتاج مستحلب على شكل ماء في الزيت (W / O) أو زيت في الماء (O / W) 2. يمكن لمستحلب النانو O / W أن ينتج السيتوكينات والكيموكينات في موقع الحقن ، ويحفز التجميع السريع وتكاثر الخلايا المناعية المهمة مثل الخلايا الوحيدة ، والعدلات ، والحمضات ، ويعزز الاستجابة المناعية ، ويحسن مناعة المستضدات3. حاليا ، تم ترخيص ثلاثة مواد مساعدة للمستحلب النانوي (MF59 و AS03 و AF03) للاستخدام في اللقاحات وأظهرت سلامة وفعالية جيدة4.
ومع ذلك ، فقد تمت معالجة المناعة المخاطية بشكل سيئ من خلال التركيبات المساعدة المرخصة حاليا في التطعيم بالحقن التقليدي5. تم الإبلاغ عن أن حمض الريتينويك (RA) يحفز توجيه الخلايا المناعية المعوية ، لكن قطبية منخفضة ، وضعف قابلية الذوبان في الماء ، وضعف الضوء والاستقرار الحراري تحد من استخدامه للتطعيم المعوي القوي. توفر المستحلبات النانوية فرصا لزيادة التوافر البيولوجي للأدوية شديدة المحبة للدهون ، كما أن قلب الزيت للمواد المساعدة لمستحلب O / W مناسب لإذابة المواد غير القطبية مثل RA6. لذلك ، يمكن استخدام المستحلبات النانوية كناقلات لالتهاب المفاصل الروماتويدي من أجل تحقيق تأثير الاستجابة المزدوجة للمناعة الجهازية والمناعة المخاطية.
بالمقارنة مع أنظمة التوصيل المحايدة أو الأنيونية ، تتمتع أنظمة التوصيل الكاتيوني بقدرات تغليف وتوصيل مستضد فعالة نسبيا ، والتي يمكن أن تعزز مناعة المستضدات7،8،9. تعتبر شحنة السطح الكاتيوني لمجموعة متنوعة من الأنظمة المساعدة مهمة لتأثيراتها المساعدة10،11،12. تعتبر الشحنة الكاتيونية عاملا مهما في إطالة فترة الاحتفاظ باللقاح في موقع الحقن ، وزيادة عرض المستضد وإطالة تحفيز المناعة الخلوية في الجسم12.
بناء على الاعتبارات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير مستحلب نانوي كاتيوني للمشاركة في توصيل RA والمستضدات بشكل فعال. تم تحديد حجم الجسيمات وإمكانات زيتا للمستحلب النانوي باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، وتم تقييم الاستجابات المناعية الجهازية والمخاطية للمستحلب النانوي جنبا إلى جنب مع OVA عن طريق الحقن العضلي13.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير حمض الريتينويك المغلف بمستحلب نانوي كاتيوني لاستخدامه كمساعد لتعزيز الاستجابات الجهازية والمخاطية الخاصة بالمستضد. بالمقارنة مع المواد المساعدة التقليدية NE ، فإنه يتمتع بميزتين التاليتين. أولا ، بشكل عام ، يحتوي سطح O / W NEs على شحنة سالبة عالية ، مما يجعل م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل البرنامج الرئيسي لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (رقم cstc2020jcyj-zdxmX0027) ومشروع مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 32270988).
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O’Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. Traversing the skin barrier with nano-emulsions. Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
