Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

Ga&#235;lle Hayot; Daniel Marcato; Christina A. Cramer von Clausbruch; Giuseppina Pace; Uwe Str&#228;hle; John K. Colbourne; Christian Pylatiuk; Ravindra Peravali; Carsten Weiss; Stefan Scholz; Thomas Dickmeis

doi:10.3791/66153

JoVE Journal > Biology

生物学

Avaliando a toxicidade de produtos químicos usando um sistema de triagem de resposta de sobressalto de vibração de peixe-zebra

Published: January 12, 2024

doi:

10.3791/66153

Gaëlle Hayot¹, Daniel Marcato^1,2, Christina A. Cramer von Clausbruch¹, Giuseppina Pace¹, Uwe Strähle^1,3, John K. Colbourne⁴, Christian Pylatiuk⁵, Ravindra Peravali¹, Carsten Weiss¹, Stefan Scholz⁶, Thomas Dickmeis¹

¹Institute of Biological and Chemical Systems – Biological Information Processing,Karlsruhe Institute of Technology – Campus Nord, ²DITABIS AG – Digital Biomedical Imaging Systems AG, ³Centre for Organismal Studies,Heidelberg University, ⁴School of Biosciences,University of Birmingham, ⁵Institute for Automation and Applied Informatics,Karlsruhe Institute of Technology – Campus Nord, ⁶Department of Bioanalytical Ecotoxicology,Helmholtz-Centre for Environmental Research – UFZ

Summary

Descrevemos o fluxo de trabalho e a análise de dados de um sistema de triagem para avaliar a toxicidade de compostos químicos com base na resposta de sobressalto de vibração de embriões de peixe-zebra. O sistema registra os movimentos de embriões de peixe-zebra após exposição a um estímulo vibratório e permite uma avaliação integrada da toxicidade/letalidade geral e toxicidade neuromuscular.

Abstract

Desenvolvemos um sistema de triagem simples para a avaliação da toxicidade neuromuscular e geral em embriões de zebrafish. O sistema modular consiste em transdutores eletrodinâmicos acima dos quais podem ser colocadas placas de cultura de tecidos com embriões. Vários desses pares de placas de cultura de alto-falante e tecido podem ser combinados. Estímulos vibracionais gerados pelos transdutores eletrodinâmicos induzem uma resposta característica de sobressalto e escape nos embriões. Um acionamento linear acionado por correia posiciona sequencialmente uma câmera acima de cada alto-falante para registrar o movimento dos embriões. Dessa forma, alterações na resposta de sobressalto devido à letalidade ou toxicidade neuromuscular de compostos químicos podem ser visualizadas e quantificadas. Apresentamos um exemplo do fluxo de trabalho para a triagem de compostos químicos usando este sistema, incluindo a preparação de embriões e soluções de tratamento, operação do sistema de registro e análise de dados para calcular valores de concentração de referência de compostos ativos no ensaio. A montagem modular baseada em componentes simples disponíveis comercialmente torna este sistema econômico e flexível adaptável às necessidades de configurações de laboratório específicas e propósitos de peneiramento.

Introduction

Nos últimos anos, o peixe-zebra tornou-se um organismo modelo altamente popular para a avaliação dos efeitos de compostos químicos, abrangendo áreas de pesquisa desde o desenvolvimento de fármacos até a toxicologia ambiental¹. Como vertebrados, os peixes-zebra compartilham muitos aspectos de sua composição genética e fisiologia geral com os seres humanos ^2,3. Portanto, os resultados obtidos nesse modelo muitas vezes são diretamente relevantes para a saúde humana. Vários candidatos a fármacos atualmente em ensaios clínicos foram identificados em telas compostas utilizando zebrafish⁴.

A avaliação da toxicidade é uma das principais aplicações em que testes utilizando estágios embrionários de peixe-zebra são de interesse. Existem várias directrizes de ensaio da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Económico (OCDE) para a utilização do peixe-zebra em ensaios de toxicidade ambiental ^5,6. O pequeno tamanho e o rápido desenvolvimento dos embriões de peixe-zebra os tornam altamente adequados para abordagens de triagem em escala de médio a alto rendimento ^1,3,4. Os desfechos toxicológicos visados por esses rastreios incluem malformações embrionárias e letalidade⁷, desregulação endócrina⁸, toxicidade orgânica⁹ e avaliações comportamentais indicativas de toxicidade neural^10,11. Os ensaios comportamentais são possíveis porque embriões de peixe-zebra apresentam vários tipos de respostas locomotoras a diferentes estímulos, dependendo de seu estágio de desenvolvimento. Por exemplo, embriões 1 dia após a fertilização (dpf) apresentam enrolamento espontâneo da^cauda12 e respondem a uma sequência de pulsos de luz com uma sequência típica de movimentos, a chamada resposta fotomotora (RPM)¹⁰. Após a eclosão, tipicamente ocorrendo por volta de 48-72 horas após a fecundação (hpf), os eleutheroembriões de natação livre¹³ gradualmente desenvolvem respostas de sobressalto e escape a estímulos vibracionais a partir de cerca de 4 dpf¹⁴. Essas respostas são caracterizadas por uma curvatura distinta na direção oposta à direção do estímulo (a chamada curva C ou C-start), que é seguida por uma menor contrainclinação e comportamento de natação 14,15,16,17. Notavelmente, os comportamentos embrionários são governados por circuitos neurais usando vários sistemas de neurotransmissores, permitindo sondar efeitos de compostos químicos visando esses sistemas. Por exemplo, o ensaio de RPM revelou os efeitos de compostos interferindo na sinalização colinérgica, adrenérgica e dopaminérgica¹⁰, enquanto a resposta de sobressalto envolve neurônios colinérgicos, glutamatérgicos e glicinérgicos ^16,18. Além disso, compostos que danificam a musculatura ou a interface neuromuscular também afetarão esses comportamentos, assim como compostos tóxicos para as células ciliadas da orelha interna/linha lateral^19,20. Observar o comportamento locomotor do peixe-zebra em resposta a um estímulo é, portanto, um meio adequado para avaliar não apenas a neurotoxicidade, mas igualmente a ototoxicidade e a miotoxicidade. A pontuação do comportamento locomotor também serve como proxy para a avaliação geral de toxicidade/letalidade, uma vez que embriões mortos não se movem. Assim, os comportamentos de locomoção embrionária representam uma leitura integrativa para uma abordagem de triagem de toxicidade de primeiro nível, que indica efeitos compostos letais e neuromusculares em um setup. Tendo em vista que os eleutheroembriões já são capazes de metabolizar compostos, a abordagem também pode detectar os efeitos de produtos de transformação metabólica ^7,21,22. É importante ressaltar que os embriões de peixe-zebra não são considerados como estágio de vida protegido sob algumas legislações de proteção animal até o estágio de alimentação livre após 120 hpf¹³. Por conseguinte, são considerados uma alternativa aos ensaios de toxicidade em animais.

Figura 1: Configuração do sistema de resposta de sobressalto de vibração. (A) Visão geral do sistema. As placas com embriões expostos aos compostos de teste são colocadas no conjunto de transdutores eletrodinâmicos (“alto-falantes”). A câmera é sequencialmente movida pelo acionamento linear acionado por correia para a posição de gravação acima do transdutor alvo. (B) Visão detalhada do transdutor/alto-falante com placa de cultura de tecidos inserida na parte superior. As placas são iluminadas por baixo por uma folha de luz LED a 4000-5000 lux. Uma luz LED ao lado do alto-falante acende enquanto o estímulo é dado. (C) Imagem estática de vídeo gravada pela câmera após estimulação dos embriões. (D) Captura de tela do arquivo de configuração. (E) Captura de tela da interface do software de gravação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, descrevemos um protocolo de teste para a avaliação dos efeitos de compostos na resposta de sobressalto de vibração usando um dispositivo de teste simples de construção interna baseado em estímulos de vibração gerados por transdutores eletrodinâmicos acoplado a uma gravação de vídeo automatizada de vários embriões em movimento livre em uma placa de cultura de tecidos²³. O sistema é modular e permite o registro sequencial de várias placas de cultura de tecidos em paralelo. No setup atualmente utilizado, cinco transdutores eletrodinâmicos fornecem um estímulo vibracional (500 Hz, duração 1 ms) a placas de cultura de tecidos contendo 20 embriões colocados sobre elas (Figura 1). As placas são iluminadas por baixo a 4000-5000 lux com folhas de luz LED. Uma luz LED ao lado de cada transdutor indica períodos de aplicação do estímulo, e um osciloscópio indica as formas de onda e a frequência do estímulo aplicado (para detalhes, ver Ref. 23). O comportamento dos embriões é registrado por uma câmera de alta velocidade (Tabela de Materiais) a 1000 quadros por segundo (fps), que é movida acima do alto-falante alvo por um acionamento linear acionado por correia. Essa velocidade de gravação é necessária para resolver de forma confiável a resposta de sobressalto. O sistema fornece uma alternativa de baixo custo e adaptável individualmente aos sistemas comerciais atuais. O fluxo de trabalho preciso detalhado abaixo é atualmente realizado no âmbito da iniciativa Toxicologia de Precisão²⁴ , a fim de determinar condições de exposição adequadas para a aquisição de dados OMICS de embriões de peixe-zebra tratados com um conjunto selecionado de tóxicos.

Protocol

Toda a criação e manejo do peixe-zebra foram realizados de acordo com as normas alemãs de proteção animal e aprovados pelo Governo de Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemanha (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT). 1. Preparação de soluções-mãe de produtos químicos a serem testados Rotular o frasco para injetáveis de vidro (ou alíquota química) com o nome/abreviatura do composto, a concentração das existências e a data de preparação. Por exemplo, CdCl2_2.5 g· L-1_210813. Centrifugar a alíquota química a 2000 x g durante 1 min à temperatura ambiente (TR). Sob um exaustor, pesar o composto (se necessário) numa balança sensível a 0,001 g e transferi-lo para o frasco para injetáveis rotulado. Se o composto for um líquido, adicione-o ao frasco para injetáveis utilizando uma pipeta e uma ponta de pipeta de plástico.NOTA: Por exemplo, para o estoque de metanossulfonato de tricaína usado no exemplo de resultado mostrado na Figura 2, 400 mg foram pesados no frasco rotulado. Adicione solvente (por exemplo, água pura estéril ou dimetilsulfóxido (DMSO), dependendo das propriedades físico-químicas dos compostos) usando uma pipeta e uma ponteira de pipeta plástica. Se possível, a água é o solvente preferido.NOTA: Por exemplo, para o estoque de tricaína, uma solução de 15,3 mM em 100 mL de água foi preparada. Sele o frasco para injetáveis, agite suavemente e verifique se há precipitação. Preparar soluções-mãe diluídas (se necessário) em frascos para injetáveis de vidro utilizando pipetas e ponteiras de pipeta de plástico.NOTA: Por exemplo, não foi necessária qualquer diluição adicional para o stock de tricaína. Conservar a(s) solução(ões) mãe(s) a -20 °C até à utilização. Conservar a alíquota química restante nas mesmas condições de antes. Registre as informações de alíquota de estoque no caderno de laboratório. 2. Coleta e criação de embriões de peixe-zebra Coletar embriões em estágios de clivagem (2-8 células) a partir da desova natural de acasalamentos em grupo em placas de cultura de tecidos de 10 cm. Selecione um lote de qualidade adequada: menos de 10% de ovos não fertilizados/mortos. Limpe a louça (remova ovos não fertilizados, detritos, escamas, etc.). Colocar 60 embriões por placa de cultura de tecidos de 10 cm em 15 mL de meio E3 (NaCl 5mM, KCl 0,17mM, CaCl2 0,33mM, MgSO4 0,33mM)25. Coloque os pratos em uma câmara umidificada preparada colocando toalhas de papel embebidas em água. Criar embriões até 72 hpf em incubadora a 28,5 °C. 3. Preparação da diluição de trabalho dos produtos químicos a ensaiar Retire a solução-mãe do congelador a -20 °C e deixe descongelar. Se a solubilidade do composto for suficientemente alta, prepare diluições seriadas em meio E3 em frascos de vidro, 1 mL por réplica por concentração. Certifique-se de que a concentração é 10 vezes superior à concentração de exposição desejada. Isso evita ter que mudar todo o meio dos embriões no início da exposição. Em caso de baixa solubilidade, preparar as diluições seriadas diretamente nas concentrações de exposição desejadas, 10 mL por repetição por concentração. Verifique se há precipitação (se necessário). Se a solução tiver precipitado, registre isso e, em seguida, dilua ainda mais para atingir a próxima concentração mais alta. Verifique novamente se há precipitação. Repita até não haver precipitação. Verifique o pH da solução de exposição. Se estiver fora da faixa de pH 7,0-8,5, registre isso e prepare as soluções em E3 contendo 5 mM HEPES/pH 7,4, ajustando o pH com HCl ou NaOH. Descarte os meios de exposição não utilizados de acordo com as regulamentações locais. 4. Exposição dos embriões aos produtos químicos a testar Verifique os pratos com os embriões de 72 hpf velhos para embriões mortos/não eclodidos e removê-los. Se um lote de embriões contiver mais de 5% de ovos não eclodidos, remova o lote. Colocar 10 embriões por 6 cm de placa de cultura de tecidos em 9 mL de meio E3 (placa de exposição). Rotule as placas de exposição com o nome do composto, a concentração de exposição e o número da réplica. Por exemplo, “CdCl2 1 mg· L-1 01”. Incluir placas suficientes apenas E3 e uma placa de controlo com solvente, se necessário (ver secção 5). Adicionar 1 ml de solução de exposição a cada placa, começando pela concentração mais baixa, e agitar a placa. Para compostos com baixa solubilidade, substituir os 10 ml inteiros da placa pela solução de exposição (ver passo 3.2). Registrar a ordem temporal em que soluções compostas foram adicionadas aos embriões. Incubar as placas na câmara umidificada em estufa a 28,5 °C por 48 h até atingirem 120 hpf. 5. Realização do ensaio de sobressalto de vibração NOTA: Analise as chapas pela mesma ordem registada no passo 4.5. Cada execução deve incluir uma placa de controle E3. Ligue o computador e o dispositivo de vibração (a luz LED azul deve estar acesa). Prepare o arquivo de configuração em uma planilha, conforme visto na Figura 1D e anexado como Arquivo Suplementar 1. Registre as informações de exposição para cada uma das 5 posições da placa (composto, concentração, repetição). Abra o programa de interface geral do usuário (GUI) (disponível em https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , ID do projeto 43215.) Verifique o movimento da câmera selecionando as diferentes posições no programa GUI e observando o movimento da câmera. Retire as placas de amostra a medir da incubadora. Coloque as placas de amostra nas 5 posições (ver Figura 1A, “altifalantes”) e deixe os embriões assentarem durante vários minutos. Clique em Gravar; Uma janela será aberta para selecionar o arquivo de configuração. Selecione o arquivo de configuração apropriado preparado na etapa 5.2 para esta execução. Verificar se a descrição da amostra corresponde às amostras em cada posição (1-5). A medição será realizada automaticamente (10 s/posição). Quando o pulso sonoro é aplicado pelo programa, um LED é ligado. O registro por 10 s/posição permite a aquisição de dados suficientes para estimar a velocidade de nado e a distância percorrida antes e após a aplicação do estímulo e evita a habituação a estímulos subsequentes. Quando a gravação é concluída, a câmera volta para a posição 1 e o software começa a compactar os arquivos. Durante esse tempo, substitua as amostras pelo próximo conjunto que precisa ser medido. Vá para a etapa 5.2. para gravar a próxima execução. Quando todas as placas tiverem sido medidas, recolher as soluções de exposição. Use uma peneira para reter os embriões. Eutanásia dos embriões por resfriamento rápido em banho de gelo/isopropanol (5%). Descarte as soluções de exposição e embriões mortos de acordo com as regulamentações locais. 6. Análise dos dados Abra os dados de vídeo com o VirtualDub (1.10.4). Pontuar visualmente o número de embriões que respondem ao pulso sonoro (quando o LED de controle está aceso). Insira dados em uma planilha. Registre o nome do composto, a réplica, a concentração do composto e a porcentagem de embriões imóveis de acordo com o modelo fornecido no Arquivo Suplementar 2, que inclui o conjunto de dados de exemplo mostrado na Figura 2C.NOTA: O modelo tem uma estrutura flexível e permite principalmente a aplicação de dados de outros organismos e endpoints. Ele descreve as respostas para cada concentração e também fornece descrições de endpoint, bem como definições dos parâmetros gerados na modelagem concentração-resposta subsequente. Realizar a análise de concentração de benchmark (BMC) usando um fluxo de trabalho KNIME (KNIME analytics 4.626) com scripts R incorporados (R versão 3.6., R-packages plotrix, drc e bmd 27,28).NOTA: Em princípio, a avaliação também poderia ser realizada diretamente em R. No entanto, por conveniência e para permitir a avaliação como um serviço baseado na Web, a análise foi organizada em um fluxo de trabalho compatível com o servidor KNIME. A saída do fluxo de trabalho KNIME é fornecida no Arquivo Suplementar 3. Para obter detalhes sobre os parâmetros estatísticos gerados pelo fluxo de trabalho do KNIME, consulte este modelo. Os parâmetros estatísticos para estimar a qualidade do ajuste e os limiares para aceitar determinados valores de CMO são mostrados na Tabela 1. O próprio fluxo de trabalho do KNIME está disponível via GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). A concentração-resposta é modelada usando um modelo log-logístico de 4 parâmetros. Dois dos parâmetros de ajuste da curva podem ser fixados. Normalmente, fixar-se-ia o máximo em 100 no caso de dados percentuais. Caso nenhum efeito de fundo seja observado, o mínimo pode ser fixado em 0%.

Representative Results

A Figura 2A mostra a porcentagem de embriões imóveis em 48 ninhadas de embriões selvagens não tratados (cepa AB2O2). Em média, 14,33% dos embriões selvagens não tratados não reagem ao estímulo vibratório. Em 4 ninhadas, a porcentagem de larvas imóveis chegou a 50%, mas 75% das ninhadas apresentaram porcentagem de larvas imóveis abaixo de 20%. A Figura 2B,C mostra um exemplo de um cálculo típico de uma concentração/dose de referência (BMC/BMD29,30) para efeitos compostos na motilidade com o fluxo de trabalho de ensaio de sobressalto de vibração, como atualmente realizado no consórcio PrecisionTox24. Os valores de BMC10, BMC25 e BMC50 correspondem às concentrações em que 10%, 25% e 50% dos embriões apresentam níveis de imobilidade superiores ao de fundo, respectivamente. Apenas embriões completamente imóveis são incluídos nesse cálculo, e não aqueles que ainda apresentam respostas parciais, como apenas uma curva em C sem escape subsequente nadando ou apenas movimentos da cauda (Figura 2B). Os embriões foram expostos a 8 concentrações do inibidor de canais de sódio tricaína metanossulfonato, frequentemente utilizado para anestesia de peixes31. Os dados indicam um nível de fundo de cerca de 25% de imobilidade em resposta ao estímulo vibratório. A partir de 1% de tricaína, a motilidade é reduzida e depois cessa acima de 2,5%. O fluxo de trabalho KNIME calcula o BMC50 como 164,9 μM, o que corresponde a 1,07% de tricaína e um nível de imobilidade de 75% (Figura 2C). Os pequenos intervalos de confiança de 95% (indicados pelos tons de cinza na curva) indicam robusta reprodutibilidade dos valores de motilidade neste ensaio. A Figura 2D mostra um exemplo de um ensaio subótimo, cujos dados não devem ser usados para cálculos de BMC. Cinco grupos controle tratados com E3 com diferentes embriões derivados da mesma ninhada são mostrados (AB2O2 [linhagem selvagem] replicada 1-5). Apenas o primeiro grupo apresenta resposta quase normal, apresentando cerca de 25% de imotilidade, o que é consistente com os valores da literatura32 e aqueles obtidos no ensaio aqui descrito, como mostrado na Figura 2A, enquanto todos os outros grupos apresentam respostas comportamentais reduzidas e/ou incompletas (por exemplo, mostrando apenas uma curva C não seguida de atividade de natação, ou motilidade sem uma curva C clara no início). Tal resposta pode ocorrer quando os embriões não se desenvolvem adequadamente e estão em estado imaturo devido ao atraso no desenvolvimento, o que afeta a robustez da resposta de sobressalto14,33. Figura 2: Exemplo de um resultado típico, incluindo o cálculo da dose de referência. (A) Porcentagem de embriões não responsivos após o pulso sonoro para larvas selvagens não tratadas para 48 ninhadas (n = 10 por ninhada). A média (14,33%) e o desvio padrão (±16,19%) estão indicados em vermelho. (B) Avaliação do comportamento de resposta de sobressalto de embriões (n=20 por condição) tratados com a concentração indicada de tricaína em meio E3 ou com E3 isoladamente como controle. O comportamento é classificado de acordo com o esquema de cores e desenhos animados indicados à direita do gráfico, com cada embrião atribuído a apenas uma das seguintes classes: “imóvel”: embrião não apresenta nenhum movimento; “movimento da cauda”: o embrião mostra o movimento da cauda, mas não se curva em C nem o comportamento de natação; “motile”: o embrião apresenta movimento de natação, mas não se curva em C em resposta ao estímulo vibracional; “C-bend only”: embrião mostra C-bend, mas não escapa nadando; “C-curvatura + motil”: o embrião apresenta comportamento típico de curvatura em C seguido de natação de escape (a típica resposta de sobressalto completo). Os diferentes comportamentos são apresentados em percentagem do número total de embriões para cada tratamento. (C) Gráfico de cálculo do BMC gerado pelo fluxo de trabalho KNIME, indicando a percentagem de embriões “imóveis” para cada concentração de tratamento. As linhas azul, vermelha e preta indicam os valores de BMC10, BMC25 e BMC50, ou seja, as concentrações em que 10%, 25% e 50% dos embriões apresentam níveis de imobilidade superiores ao de fundo, respectivamente. (D) Exemplo de ensaio descartado. Cinco ensaios controle tratados com E3 com diferentes embriões selvagens AB2O2 derivados da mesma ninhada são mostrados (réplica 1-5). Apenas a réplica 1 mostra uma resposta quase normal, enquanto os embriões das corridas restantes não mostram a resposta típica de C-curva + escape nadando. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela 1: Parâmetros estatísticos para estimar a qualidade do ajuste e limiares para aceitar determinados valores de BMC. Clique aqui para baixar esta tabela. Tabela 2: Propriedades de uma seleção de sistemas de ensaio de resposta de sobressalto vibracional. Clique aqui para baixar esta tabela. Arquivo suplementar 1: modelo do Excel para arquivo de configuração. Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo suplementar 2: modelo de entrada KNIME com um conjunto de dados de exemplo. Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo suplementar 3: Exemplo de arquivo de saída KNIME. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Apresentamos o fluxo de trabalho e a análise de dados para avaliação de compostos químicos usando uma configuração personalizada de ensaio de sobressalto de vibração de embrião de peixe-zebra. O fluxo de trabalho gera dados robustos que permitem o cálculo de parâmetros típicos que especificam a toxicidade do composto, como concentração/dose de referência (BMC/BMD). A modularidade da configuração permite a adaptação a diferentes necessidades de rendimento e requisitos de espaço. Como o sistema é feito de componentes basais de baixo custo, seguindo uma configuração relativamente simples, ele fornece uma alternativa barata aos sistemas comerciais existentes, que geralmente são projetados para vários tipos de ensaio ao mesmo tempo, dependem de software proprietário e permanecem relativamente caros.

Tanto esses sistemas comerciais quanto outros sistemas feitos sob medida permitem a avaliação de embriões ou larvas isoladas em placas de poços múltiplos (por exemplo, 12 poços³⁴, 16 poços ^32,35, 24^poços 20,33,36, 48 poços³⁷, 96 poços 38,39,40,41,42 e até 384 poços [como poço 4×96]⁴³), mas a restrição espacial nos poços torna a análise de alguns parâmetros de dados da resposta de escape (por exemplo, distância percorrida) mais desafiadora. Além disso, em alguns desses setups, a imagem é restrita a um subconjunto dos poços da placa, reduzindo o rendimento^36,39. A obtenção de imagens de embriões em placas permite uma melhor avaliação dos parâmetros de resposta de escape e permite registrar o comportamento de vários embriões ao mesmo tempo (até 30 em uma placa de 6 cm, por exemplo). Geralmente, a imagem baseada em prato é limitada a um prato por corrida 44,45,46,47,48 (exceções realizam imagens em paralelo em 6 pratos com uma larva cada⁴⁹ ou em 4 larvas em 2 pratos divididos⁵⁰), uma desvantagem que pode ser resolvida por desenhos paralelos como no nosso caso. Resumimos algumas características do sistema utilizado neste estudo e de outras soluções comerciais e sob medida na Tabela 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43^, 44,45,46,47,48,49,50^,
^51,52.

Uma vantagem do método é uma leitura que captura tanto a letalidade quanto as mudanças comportamentais, o que pode aumentar o desempenho das avaliações de toxicidade. Por exemplo, embora o teste de toxicidade aguda (FET) de embrião de peixe-zebra5 tenha demonstrado predizer a toxicidade no teste de toxicidade aguda de peixes adultos⁵³, sua precisão de predição foi melhorada com a inclusão de leituras comportamentais⁵⁴. A razão para isso é a fraca mortalidade induzida por compostos neuroativos observados em embriões de peixes, provavelmente devido à ausência de síndrome de insuficiência respiratória causando maior toxicidade em peixes juvenis ou adultos. A neuroatividade pode, no entanto, ser identificada pela avaliação do comportamento. Além disso, leituras comportamentais também podem capturar efeitos miotóxicos e ototóxicos, bem como outros efeitos tóxicos mais sutis sobre a fisiologia, que são subletais, mas influenciam o desempenho comportamental do organismo.

Ao conduzir o ensaio, é fundamental garantir o manuseio adequado dos compostos, bem como usar um lote homogêneo de embriões de peixe-zebra. Assim, o uso de frascos de vidro para armazenamento de compostos deve minimizar o declínio nas concentrações de produtos químicos, particularmente compostos hidrofóbicos, devido à absorbância ao material plástico. No caso de compostos de alto potencial absortivo ao poliestireno “plástico”, placas de vidro também podem ser usadas para a incubação. A limpeza dos ovos nas placas de cultura de tecidos usadas para coleta e remoção de embriões mortos é uma etapa crítica para garantir o desenvolvimento padrão. A velocidade normal de desenvolvimento é importante, pois atrasos no desenvolvimento podem afetar a maturidade das redes neurais subjacentes ao comportamento avaliado^14,33. Além disso, para permitir a comparação dos efeitos dos compostos, os ovos devem ser derivados da mesma cepa, uma vez que diferentes cepas têm sido relatadas para apresentar perfis comportamentais diferentes 38,55,56,57. Durante a exposição, é importante incubar os embriões em câmara umidificada para evitar evaporação excessiva do meio E3, o que alteraria as concentrações testadas.

Os controlos E3 devem ser incorporados em cada ensaio, a fim de determinar o nível de resposta basal do lote específico de embriões utilizados na série de ensaios. Normalmente, executamos uma placa de controles ao longo de cada conjunto de 5 medições. Como ilustrado na Figura 2D, essa abordagem também permite a detecção de lotes com respostas subótimas devido ao atraso no desenvolvimento ou por outras razões, como efeitos genéticos de fundo. Em caso de falta inesperada de resposta ao estímulo, fique atento também a possíveis falhas do transdutor. Tipicamente, as respostas de sobressalto mostram um comportamento concentração-resposta sigmoidal que permite o ajuste da curva usando um modelo log-logístico. No entanto, em casos raros com respostas bifásicas, outros modelos podem ter que ser empregados, como os modelos Gaussiano ou Cedergreen. Eles estão disponíveis dentro dos pacotes R drc e bdm^27,28.

A falta de resposta ao estímulo vibracional pode indicar simplesmente a morte dos embriões ou funções vitais gravemente prejudicadas devido à citotoxicidade geral, mas também pode refletir toxicidade mais específica visando circuitos neurais de percepção do estímulo, integração e saída locomotora. Outros possíveis efeitos compostos são a interferência na interface neuromuscular ou na estrutura e função muscular. Para distinguir essas possibilidades, ensaios adicionais são necessários. Por exemplo, a integridade estrutural dos músculos pode ser avaliada com um ensaio de birrefringência^58,59, e linhas transgênicas estão disponíveis para avaliar a perturbância da função muscular e neural^60,61. No entanto, os dados gravados em vídeo já permitem uma análise mais detalhada da morfologia e da resposta comportamental dos embriões que podem fornecer primeiras informações adicionais. Apenas a curva C está prejudicada, ou toda a motilidade? Ainda há resquícios de atividade neuromuscular, como indicado por movimentos fracos ou trêmulos da cauda? Esses comportamentos alterados acompanham mudanças na morfologia, como edema ou aumento da curvatura corporal? Além disso, parâmetros como o tempo de latência até a curvatura C ou a distância percorrida durante a resposta de escape podem ser avaliados (ver, por exemplo, Ref. 44).

O protocolo de triagem aqui descrito permite avaliações rápidas e robustas da toxicidade de compostos, com o valor agregado de detectar especificamente compostos neurotóxicos, ototóxicos e miotóxicos não letais. O fluxo de trabalho de análise fornecido é fácil de implementar e fornece uma leitura robusta. Modificações dos protocolos de estímulo utilizados no ensaio de sobressalto de vibração têm sido utilizadas para abordar efeitos compostos também em aspectos mais complexos do comportamento de sobressalto, como inibição do pré-pulso (IBP)^39,44 e habituação32,33, e podem ser adaptadas ao arranjo de estímulo baseado em transdutor eletrodinâmico utilizado neste estudo.

Uma das principais aplicações dos sistemas de triagem baseados em resposta ao sobressalto é a avaliação dos efeitos dos compostos em telas químicas, o que é relevante tanto para a avaliação da toxicidade humana quanto para o desenvolvimento de fármacos ^1,4,62. Ao mesmo tempo, ao testar os estágios iniciais de vida de um organismo aquático, os resultados obtidos têm relevância direta para a avaliação de risco ecotoxicológico^63,64. Além disso, sistemas de resposta de sobressalto podem ser utilizados para fenotipagem comportamental em rastreamentos genéticos 65,66,67,68,69. Nosso sistema facilmente implementável e adaptável fornece uma configuração acessível para laboratórios menores que pretendem conduzir seus próprios projetos de triagem específicos nesses vários domínios de aplicação.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a excelente assistência técnica da equipe de apoio do IBCS-BIP e do centro de triagem. Este trabalho recebeu financiamento do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção n.º 965406 (PrecisionTox). Este resultado reflete apenas a opinião dos autores, e a União Europeia não pode ser responsabilizada por qualquer uso que possa ser feito das informações nele contidas.

Materials

Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm	Sigma-Aldrich	Z289744-1EA	Or comparable material
High-speed camera	XIMEA	MQ013MG-ON USB 3
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap	VWR	215-3261	Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL	SARSTEDT	70.3010.210	Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL	SARSTEDT	70.3050.100	Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL	SARSTEDT	70.3020.210	Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL	SARSTEDT	70.3030.100	Or comparable material
Serological pipette 10 mL	SARSTEDT	86.1254.001	Or comparable material
Serological pipette 25 mL	SARSTEDT	86.1685.001	Or comparable material
Serological pipette 5 mL	SARSTEDT	86.1253.001	Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene)	Greiner bio-one	628102	Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene)	SARSTEDT	83.3902.500	Or comparable material
Transfer pipette 6 mL	SARSTEDT	86.1175	Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP	SARSTEDT	62.554.502	Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP	SARSTEDT	62.5472.54	Or comparable material

References

MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2013).
OECD. Test No. 250: EASZY assay – Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2021).
Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments–a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
Marcato, D. . Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , (2018).
PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
Nüsslein-Volhard, C. . Zebrafish – A Practical Approach. , (2002).
Berthold, M. R., Preisach, C. h. r. i. s. t. i. n. e., Burkhardt, H. a. n. s., Schmidt-Thieme, L. a. r. s., Decker, R. e. i. n. h. o. l. d., et al. . Data Analysis, Machine Learning and Applications. , (2008).
Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2019).
Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment–applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Hayot, G., Marcato, D., Cramer von Clausbruch, C. A., Pace, G., Strähle, U., Colbourne, J. K., Pylatiuk, C., Peravali, R., Weiss, C., Scholz, S., Dickmeis, T. Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System. J. Vis. Exp. (203), e66153, doi:10.3791/66153 (2024).