JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Оценка токсичности химических веществ с помощью системы скрининга вибрационной реакции на испуг рыбок данио

Published: January 12, 2024
doi:
10.3791/66153
, , , , , , , , , ,
1Institute of Biological and Chemical Systems – Biological Information Processing,Karlsruhe Institute of Technology – Campus Nord, 2DITABIS AG – Digital Biomedical Imaging Systems AG, 3Centre for Organismal Studies,Heidelberg University, 4School of Biosciences,University of Birmingham, 5Institute for Automation and Applied Informatics,Karlsruhe Institute of Technology – Campus Nord, 6Department of Bioanalytical Ecotoxicology,Helmholtz-Centre for Environmental Research – UFZ

Summary

Мы описываем рабочий процесс системы скрининга и анализ данных для оценки токсичности химических соединений на основе вибрационной реакции эмбриона рыбки данио. Система регистрирует движения эмбрионов рыбок данио при воздействии вибрационного стимула и позволяет комплексно оценить общую токсичность/летальность и нервно-мышечную токсичность.

Abstract

Мы разработали простую систему скрининга для оценки нервно-мышечной и общей токсичности у эмбрионов рыбок данио. Модульная система состоит из электродинамических датчиков, над которыми могут быть размещены чашки для культивирования тканей с эмбрионами. Можно комбинировать несколько таких пар громкоговоритель-тканевая культуральная чашка. Вибрационные стимулы, генерируемые электродинамическими преобразователями, вызывают у эмбрионов характерную реакцию испуга и убегания. Линейный привод с ременным приводом последовательно размещает камеру над каждым громкоговорителем для записи движения эмбрионов. Таким образом, изменения в реакции испуга из-за летальности или нервно-мышечной токсичности химических соединений могут быть визуализированы и количественно оценены. Мы представляем пример рабочего процесса скрининга химических соединений с использованием этой системы, включая подготовку эмбрионов и лечебных растворов, работу системы регистрации и анализ данных для расчета эталонных значений концентрации соединений, активных в анализе. Модульная сборка, основанная на коммерчески доступных простых компонентах, делает эту систему экономичной и гибко адаптируемой к потребностям конкретных лабораторных установок и целей скрининга.

Introduction

В последние годы рыбки данио-рерио стали очень популярными модельными организмами для оценки эффектов химических соединений, охватывающих области исследований от разработки лекарств до токсикологииокружающей среды. Как позвоночные, рыбки данио-рерио имеют много общего с человекомво многих аспектах своего генетического состава и общей физиологии 2,3. Поэтому результаты, полученные в этой модели, часто имеют непосредственное отношение к здоровью человека. Несколько кандидатов в лекарственные препараты, которые в настоящее время проходят клинические испытания, были идентифицированы при скрининге соединений с использованием рыбок данио-рерио4.

Оценка токсичности является одним из основных применений, в котором представляют интерес испытания с использованием эмбриональных стадий рыбок данио. Существуют различные рекомендации Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) по проведению испытаний рыбок данио-рерио при испытаниях на токсичность в окружающей среде 5,6. Небольшой размер и быстрое развитие эмбрионов данио-рерио делают их очень подходящими для скрининговых подходов по шкалесредней и высокой производительности 1,3,4. Токсикологические конечные точки, на которые нацелены такие скрининги, включают эмбриональные пороки развития и летальность7, эндокринные нарушения8, токсичность органов9 и поведенческие оценки, указывающие на нейротоксичность10,11. Поведенческие тесты возможны потому, что эмбрионы рыбок данио демонстрируют различные типы локомоторных реакций на различные стимулы в зависимости от стадии их развития. Например, через 1 день после оплодотворения эмбрионы демонстрируют спонтанное сворачивание хвоста12 и реагируют на последовательность световых импульсов типичной последовательностью движений, так называемой фотомоторной реакцией (PMR)10. После вылупления, обычно происходящего примерно через 48-72 часа после оплодотворения (ВПФ), свободно плавающие элеутероэмбрионы13 постепенно развивают реакцию испуга и убегания от вибрационных стимулов, начиная примерно с 4 dpf14. Эти реакции характеризуются характерным изгибом в направлении, противоположном направлению стимула (так называемый С-изгиб или С-старт), за которым следует меньший встречный изгиб и плавательное поведение 14,15,16,17. Примечательно, что эмбриональное поведение регулируется нейронными цепями, использующими различные нейротрансмиттерные системы, что позволяет исследовать химические эффекты, нацеленные на эти системы. Например, анализ PMR выявил эффекты соединений, препятствующих холинергической, адренергической и дофаминергической сигнализации10, в то время как реакция испуга включает холинергические, глутаматергические и глицинергические нейроны16,18. Кроме того, соединения, которые повреждают мышцы или нервно-мышечный интерфейс, также влияют на это поведение, как и соединения, токсичные для волосковых клеток внутреннего уха/боковой линии19,20. Таким образом, наблюдение за локомоторным поведением рыбок данио-рерио в ответ на стимул является подходящим средством для оценки не только нейротоксичности, но и ототоксичности и миотоксичности. Оценка локомоторного поведения также служит показателем для оценки общей токсичности/летальности, поскольку мертвые эмбрионы не двигаются. Таким образом, эмбриональное локомоционное поведение представляет собой интегративное считывание для подхода к скринингу токсичности первого уровня, который указывает на летальные и нервно-мышечные эффекты в одной установке. Учитывая, что элеутероэмбрионы уже способны метаболизировать соединения, этот подход может также обнаружить эффекты продуктов метаболической трансформации 7,21,22. Важно отметить, что эмбрионы рыбок данио-рерио не считаются защищенной стадией жизни в соответствии с некоторыми законами о защите животных до стадии свободного кормления после 120 hpf13. Поэтому они рассматриваются как альтернатива тестированию на токсичность для животных.

Figure 1
Рисунок 1: Настройка системы реагирования на вибрационный испуг. (A) Общие сведения о системе. Планшеты с эмбрионами, подвергшимися воздействию исследуемых соединений, помещают на матрицу электродинамических преобразователей («громкоговорители»). Линейный привод с ременным приводом последовательно перемещает камеру в положение записи над целевым преобразователем. (B) Детальный вид датчика/громкоговорителя с чашкой для культивирования тканей, вставленной сверху. Плиты подсвечиваются снизу светодиодным световым полотном на 4000-5000 люкс. Светодиодная лампочка рядом с динамиком загорается во время подачи стимула. (C) Неподвижное изображение видео, записанное камерой при стимуляции эмбрионов. (D) Скриншот конфигурационного файла. (E) Снимок экрана интерфейса программного обеспечения для записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

В данной работе мы описываем протокол тестирования для оценки комплексных эффектов на реакцию вибрационного испуга с использованием простого испытательного устройства собственной разработки, основанного на вибрационных стимулах, генерируемых электродинамическими преобразователями, в сочетании с автоматизированной видеозаписью нескольких свободно движущихся эмбрионов в чашке для культивирования тканей23. Система является модульной и позволяет вести последовательную запись из нескольких чашек для культуры тканей параллельно. В используемой в настоящее время установке пять электродинамических преобразователей подают вибрационный стимул (500 Гц, длительность 1 мс) на чашки для культивирования тканей, содержащие 20 эмбрионов, помещенных на них (рис. 1). Плиты подсвечиваются снизу на 4000-5000 люкс светодиодными световыми полотнами. Светодиодный индикатор рядом с каждым преобразователем показывает периоды применения стимула, а осциллограф показывает осциллограммы и частоту применяемого стимула (подробнее см . Ref. 23). Поведение эмбрионов записывается высокоскоростной камерой (Table of Materials) со скоростью 1000 кадров в секунду (fps), которая перемещается над целевым динамиком с помощью линейного привода с ременным приводом. Такая скорость записи необходима для надежного разрешения реакции испуга. Система представляет собой недорогую, индивидуально адаптируемую альтернативу существующим коммерческим системам. Точный рабочий процесс, описанный ниже, в настоящее время выполняется в рамках инициативы «Прецизионная токсикология»24 с целью определения подходящих условий воздействия для сбора данных OMICS от эмбрионов рыбок данио, обработанных выбранным набором токсикантов.

Protocol

Все работы по разведению и обращению с рыбками данио осуществлялись в соответствии с немецкими стандартами защиты животных и были одобрены правительством земли Баден-Вюртемберг, Regierungspräsidium Karlsruhe, Германия (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT). 1. Подготовка исходных растворов химических реагентов для испытаний Наклейте на стеклянный флакон (или химический аликвоту) наименование/аббревиатуру соединения, концентрацию сырья и дату приготовления. Например, CdCl2_2,5 г· Л-1_210813. Центрифугируют аликвоту химиката при 2000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре (RT). Под вытяжным шкафом взвесьте соединение (при необходимости) на весах, чувствительных к 0,001 г, и перелейте его в маркированный флакон. Если соединение представляет собой жидкость, добавьте его во флакон с помощью пипетки и пластикового наконечника для пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для трикаинметансульфоната, используемого в результате, показанном на рисунке 2, 400 мг взвешивали в маркированном флаконе. Добавьте растворитель (например, стерильную чистую воду или диметилсульфоксид (ДМСО), в зависимости от физико-химических свойств соединений) с помощью пипетки и пластикового наконечника для пипетки. По возможности предпочтительным растворителем является вода.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для трикаиновой массы был приготовлен раствор 15,3 мМ в 100 мл воды. Закройте флакон, осторожно встряхните и проверьте наличие осадков. Готовят разбавленные исходные растворы (при необходимости) в стеклянных флаконах с помощью пипеток и пластиковых наконечников для пипеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для трикаиновой массы не потребовалось дальнейшее разбавление. Храните исходный раствор (растворы) при температуре -20 °C до использования. Оставшуюся химическую аликвоту хранят в тех же условиях, что и раньше. Запишите информацию о запасах в лабораторную записную книжку. 2. Сбор и выращивание эмбрионов рыбок данио-рерио Собирают эмбрионы в стадиях расщепления (стадия 2-8 клеток) из естественного нереста групповых спариваний в 10 см чашки для культивирования тканей. Выберите партию соответствующего качества: менее 10% неоплодотворенных/мертвых яиц. Очистите посуду (удалите неоплодотворенные яйца, мусор, чешую и т.д.). Помещают 60 эмбрионов в чашку для культивирования тканей диаметром 10 см в 15 мл среды E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4)25. Поместите посуду в подготовленную увлажненную камеру, разложив бумажные полотенца, смоченные водой. Выращивают эмбрионы до 72 hpf в инкубаторе при температуре 28,5 °C. 3. Приготовление рабочего разбавления испытуемых химикатов Достаньте исходный раствор из морозильной камеры с температурой -20 °C и дайте ему оттаять. Если растворимость соединения достаточно высока, готовят серийные разведения в среде Е3 в стеклянных флаконах по 1 мл на репликацию на концентрацию. Убедитесь, что концентрация в 10 раз превышает желаемую концентрацию воздействия. Это позволяет избежать необходимости менять всю среду эмбрионов в начале экспозиции. В случае низкой растворимости приготовьте серийные разведения непосредственно в требуемых концентрациях экспозиции, 10 мл на репликацию на концентрацию. Проверьте наличие осадков (при необходимости). Если раствор выпал в осадок, запишите это, а затем еще больше разбавьте до достижения следующей наибольшей концентрации. Проверьте еще раз наличие осадков. Повторяйте до тех пор, пока не исчезнут осадки. Проверьте рН экспозиционного раствора. Если рН выходит за пределы диапазона 7,0-8,5, запишите это и приготовьте растворы в Е3, содержащие 5 мМ HEPES/рН 7,4, регулируя рН HCl или NaOH. Утилизируйте неиспользованные среды воздействия в соответствии с местными правилами. 4. Воздействие на эмбрионы испытуемых химических веществ Проверьте чашки со старыми эмбрионами 72 hpf на наличие мертвых/невылупившихся эмбрионов и удалите их. Если партия эмбрионов содержит более 5% невылупившихся яиц, удалите партию. Поместите 10 эмбрионов в чашку для культивирования тканей диаметром 6 см в 9 мл среды Е3 (экспонционная пластина). Маркируйте пластины с указанием названия соединения, концентрации экспозиции и номера репликации. Например, “CdCl2 1 мг· Л-1 01”. При необходимости включите достаточное количество планшетов, предназначенных только для E3, и пластину контроля растворителя (см. раздел 5). Добавьте 1 мл экспозиционного раствора в каждую чашку, начиная с самой низкой концентрации, и перемешайте планшет. Для соединений с низкой растворимостью замените все 10 мл планшета раствором для экспонирования (см. шаг 3.2). Запишите временной порядок, в котором сложные растворы были добавлены к эмбрионам. Инкубируйте планшеты в увлажненной камере в инкубаторе при температуре 28,5 °C в течение 48 ч, пока они не достигнут 120 hpf. 5. Проведение анализа вибрационного испуга ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируйте пластины в том же порядке, что и на шаге 4.5. Каждый прогон должен включать в себя контрольную пластину E3. Включите компьютер и вибрационное устройство (должен гореть синий светодиод). Подготовьте конфигурационный файл в виде электронной таблицы, как показано на рисунке 1D и приложенного к нему в качестве дополнительного файла 1. Запишите информацию об экспозиции для каждого из 5 положений пластины (соединение, концентрация, репликация). Откройте программу общего пользовательского интерфейса (GUI) (доступна по адресу https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit, код проекта 43215). Проверяйте движение камеры, выбирая различные положения в программе с графическим интерфейсом и наблюдая за движением камеры. Выньте из инкубатора планшеты для измерения образцов. Поместите планшеты с образцами в 5 позиций (см. Рисунок 1A, «громкоговорители») и дайте эмбрионам отстояться в течение нескольких минут. Нажмите на кнопку «Запись»; Откроется окно для выбора конфигурационного файла. Выберите соответствующий конфигурационный файл, подготовленный на шаге 5.2 для этого запуска. Убедитесь, что описание образца соответствует образцам в каждой позиции (1-5). Измерение будет проводиться автоматически (10 с/положение). Когда программа подает звуковой импульс, загорается светодиод. Запись в течение 10 с/положение позволяет получить достаточно данных для оценки скорости плавания и пройденного расстояния как до, так и после применения стимула, а также предотвращает привыкание к последующим стимулам. Когда запись завершена, камера возвращается в положение 1, и программное обеспечение начинает сжимать файлы. За это время замените образцы следующим набором, который необходимо измерить. Перейдите к шагу 5.2. , чтобы записать следующий запуск. Когда все пластины будут измерены, соберите растворы для воздействия. Используйте сито для удержания эмбрионов. Усыпляют эмбрионы быстрым охлаждением в ванне со льдом/изопропанолом (5%). Утилизируйте контактные растворы и мертвые эмбрионы в соответствии с местными правилами. 6. Анализ данных Откройте видеоданные с помощью VirtualDub (1.10.4). Визуально оцените количество эмбрионов, реагирующих на звуковой импульс (при горящем контрольном светодиоде). Внесите данные в электронную таблицу. Запишите название соединения, репликацию, концентрацию соединения и процент неподвижных эмбрионов в соответствии с шаблоном, приведенным в дополнительном файле 2, который включает пример набора данных, показанный на рисунке 2C.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон имеет гибкую структуру и в принципе позволяет применять данные других организмов и конечных точек. В нем описываются отклики для каждой концентрации, а также приводятся описания конечных точек, а также определения параметров, сгенерированных при последующем моделировании концентрации-отклика. Проводите анализ эталонной концентрации (BMC) с помощью рабочего процесса KNIME (KNIME analytics 4.626) со встроенными скриптами R (R версии 3.6., R-пакеты plotrix, drc и bmd 27,28).ПРИМЕЧАНИЕ: В принципе, оценка может быть проведена непосредственно в R. Тем не менее, для удобства и возможности оценки в виде веб-сервиса, анализ был организован в рабочем процессе, совместимом с сервером KNIME. Выходные данные рабочего процесса KNIME приведены в дополнительном файле 3. Подробные сведения о статистических параметрах, генерируемых рабочим процессом KNIME, см. в этом шаблоне. Статистические параметры для оценки пригодности и пороговые значения для принятия определенных значений BMC приведены в таблице 1. Сам рабочий процесс KNIME доступен на GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). Концентрация-реакция моделируется с помощью 4-параметрической логарифмической логистической модели. Два параметра аппроксимации кривой могут быть зафиксированы. Как правило, максимальное значение устанавливается равным 100 в случае процентных данных. В случае, если фоновых эффектов не наблюдается, минимальное значение может быть установлено равным 0%.

Representative Results

На рисунке 2А показано процентное содержание неподвижных эмбрионов в 48 кладках необработанных эмбрионов дикого типа (штамм AB2O2). В среднем, 14,33% необработанных эмбрионов дикого типа не реагируют на вибрационный раздражитель. В 4 кладках процент неподвижных личинок достигал 50%, но в 75% кладок процент неподвижных личинок был ниже 20%. На рисунке 2B, C показан пример типичного расчета эталонной концентрации/дозы (BMC/BMD29,30) для комплексного воздействия на подвижность с помощью рабочего процесса анализа вибрационного испуга, который в настоящее время выполняется в консорциуме PrecisionTox24. Значения BMC10, BMC25 и BMC50 соответствуют концентрациям, при которых у 10%, 25% и 50% эмбрионов уровень неподвижности выше фонового соответственно. В этот расчет включаются только те эмбрионы, которые полностью неподвижны, а не те, которые все еще демонстрируют частичные реакции, такие как только С-образный изгиб без последующего плавания или только движения хвостом (рис. 2B). Эмбрионы подвергались воздействию 8 концентраций ингибитора натриевых каналов трикаина метансульфоната, который часто используется для обезболивания рыб31. Данные указывают на фоновый уровень неподвижности около 25% в ответ на вибрационный стимул. Начиная с 1% трикаина, подвижность снижается, а затем перестает превышать 2,5%. Рабочий процесс KNIME рассчитывает BMC50 как 164,9 мкМ, что соответствует 1,07% трикаина и уровню неподвижности 75% (рис. 2C). Малые 95% доверительные интервалы (обозначенные серыми оттенками на кривой) указывают на надежную воспроизводимость значений подвижности в этом анализе. На рисунке 2D показан пример неоптимального прогона, данные которого не следует использовать для расчетов BMC. Показаны пять контрольных групп, получавших Е3, с разными эмбрионами, полученными из одной и той же кладки (AB2O2 [штамм дикого типа] реплицируют 1-5). Только первая группа показала почти нормальную реакцию, демонстрируя около 25% неподвижности, что согласуется с литературными значениями32 и теми, которые были получены в тесте, описанном здесь, как показано на рисунке 2А, в то время как все остальные группы демонстрируют сниженные и/или неполные поведенческие реакции (например, показывают только С-изгиб, за которым не следует плавание, или моторику без четкого С-изгиба в начале). Такая реакция может возникать, когда эмбрионы не развиваются должным образом и находятся в незрелом состоянии из-за задержки развития, что влияет на устойчивость реакции испуга14,33. Рисунок 2: Пример типичного результата, включая расчет эталонной дозы. (A) Процент нечувствительных эмбрионов после звукового импульса для необработанных личинок дикого типа для 48 кладок (n = 10 на кладку). Красным цветом обозначены среднее значение (14,33%) и стандартное отклонение (±16,19%). (B) Оценка поведения эмбрионов при испуге (n=20 на условие), получавших указанную концентрацию трикаина в среде Е3 или только Е3 в качестве контроля. Поведение классифицируется в соответствии с цветовой схемой и рисунками, указанными справа от графика, при этом каждый эмбрион относится только к одному из следующих классов: «неподвижный»: эмбрион не показывает никакого движения; “движение хвостом”: эмбрион не показывает движения хвоста, но не показывает ни С-изгиба, ни плавательного поведения; «подвижный»: эмбрион демонстрирует плавательные движения, но не изгибается в ответ на вибрационный раздражитель; “C-bend only”: эмбрион демонстрирует С-изгиб, но не избегает плавания; “С-изгиб + подвижность”: эмбрион демонстрирует типичное поведение С-изгиба, за которым следует ускользающее плавание (типичная реакция полного испуга). Различное поведение показано в процентах от общего количества эмбрионов для каждого лечения. (C) График расчета BMC, сгенерированный рабочим процессом KNIME, показывающий процент «неподвижных» эмбрионов для каждой лечебной концентрации. Синей, красной и черной линиями обозначены значения BMC10, BMC25 и BMC50, т.е. концентрации, при которых 10%, 25% и 50% эмбрионов демонстрируют уровень неподвижности выше фонового соответственно. (D) Пример отбракованного прогона. Показаны пять контрольных прогонов, обработанных Е3, с различными эмбрионами AB2O2 дикого типа, полученными из одной и той же кладки (реплики 1-5). Только репликация 1 показывает почти нормальную реакцию, в то время как эмбрионы остальных прогонов не показывают типичной реакции С-изгиба + плавание в бегство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Таблица 1: Статистические параметры для оценки пригодности и пороговые значения для принятия определенных значений BMC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 2: Свойства выборки систем анализа вибрационного испуга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Дополнительный файл 1: Шаблон Excel для конфигурационного файла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2: Входной шаблон KNIME с примером набора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительный файл 3: Пример выходного файла KNIME. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Мы представляем рабочий процесс и анализ данных для оценки химических соединений с использованием специально разработанной установки для вибрационного анализа эмбрионов рыбок данио. Рабочий процесс генерирует надежные данные, которые позволяют рассчитывать типичные параметры, определяющие токсичность соединения, такие как эталонная концентрация/доза (BMC/BMD). Модульная конструкция позволяет адаптироваться к различным требованиям к пропускной способности и пространству. Поскольку система изготовлена из недорогих базальных компонентов после относительно простой настройки, она представляет собой дешевую альтернативу существующим коммерческим системам, которые, как правило, предназначены для нескольких типов анализов одновременно, полагаются на проприетарное программное обеспечение и остаются относительно дорогими.

Как эти коммерческие системы, так и другие системы, изготовленные по индивидуальному заказу, позволяют оценивать одиночные зародыши или личинки в многолуночных планшетах (например, 12-луночные34, 16-луночные32,35, 24-луночные 20,33,36, 48-луночные37, 96-луночные 38,39,40,41,42 и даже 384-луночные [как 4×96 лунки]43), но пространственное ограничение в скважинах затрудняет анализ некоторых параметров данных убегающего отклика (например, пройденного расстояния). Кроме того, в некоторых из этих установок визуализация ограничивается подмножеством лунок пластины, что снижает пропускную способность36,39. Визуализация эмбрионов в чашках позволяет лучше оценить параметры реакции на побег и позволяет регистрировать поведение сразу нескольких эмбрионов (например, до 30 в чашке диаметром 6 см). Обычно визуализация в чашке ограничивается одной чашкой за один прогон 44,45,46,47,48 (исключения выполняются параллельно на 6 чашках с одной личинкой в каждой49 или на 4 личинках в 2 разделенных чашках50), недостаток, который может быть решен параллельными конструкциями, как в нашем случае. Мы обобщили некоторые характеристики системы, использованной в данном исследовании, и других коммерческих и заказных решений в таблице 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
С. 51,52.

Одним из преимуществ метода является считывание, фиксирующее как летальность, так и поведенческие изменения, что может повысить эффективность оценки токсичности. Например, в то время как было показано, что тест на острую токсичность эмбриона рыбки данио-рерио (FET)5 достаточно хорошо предсказывает токсичность в тесте на острую токсичностьвзрослой рыбы 53 , его точность прогнозирования была улучшена за счет включения поведенческих индикаторов54. Причиной этого является слабая смертность, индуцированная нейроактивными соединениями, наблюдаемыми в эмбрионах рыб, вероятно, из-за отсутствия синдрома дыхательной недостаточности, вызывающего повышенную токсичность у молоди или взрослых рыб. Тем не менее, нейроактивность может быть идентифицирована путем оценки поведения. Кроме того, поведенческие индикаторы могут также фиксировать миотоксические и ототоксические эффекты, а также другие, более тонкие токсические эффекты на физиологию, которые являются сублетальными, но влияют на поведенческие показатели организма.

При проведении анализа очень важно обеспечить надлежащее обращение с соединениями, а также использовать однородно развивающуюся партию эмбрионов рыбок данио. Таким образом, использование стеклянных флаконов для хранения соединений должно свести к минимуму снижение концентраций химических веществ, особенно гидрофобных соединений, из-за абсорбции к пластиковому материалу. В случае соединений с высоким поглощающим потенциалом к «пластичному» полистиролу для инкубации также можно использовать стеклянные пластины. Очистка яйцеклеток в чашках для культивирования тканей, используемых для сбора и удаления мертвых эмбрионов, является критически важным шагом для обеспечения стандартного развития. Нормальная скорость развития важна, так как задержки в развитии могут повлиять на зрелость нейронных сетей, лежащих в основе оцениваемого поведения 14,33. Кроме того, чтобы можно было сравнивать сложные эффекты, яйца должны быть получены из одного и того же штамма, поскольку разные штаммы, как сообщается, имеют разные поведенческие профили 38,55,56,57. Во время экспозиции важно инкубировать эмбрионы в увлажненной камере, чтобы избежать чрезмерного испарения среды E3, которое может изменить испытуемую концентрацию.

Контрольные элементы E3 должны быть включены в каждый запуск, чтобы определить базовый уровень ответа конкретной партии эмбрионов, используемых в серии тестов. Как правило, мы запускаем одну контрольную пластину для каждого набора из 5 измерений. Как показано на рисунке 2D, этот подход также позволяет обнаруживать партии с неоптимальными реакциями из-за задержки развития или по другим причинам, таким как генетические фоновые эффекты. В случае неожиданного отсутствия реакции на раздражитель также следите за возможным выходом из строя датчика. Как правило, реакция испуга демонстрирует сигмоидальное поведение «концентрация-реакция», которое позволяет аппроксимировать кривую с помощью логарифмической логистической модели. Однако в редких случаях с двухфазными ответами может потребоваться использование других моделей, таких как модели Гаусса или Седергрина. Они доступны в пакетах R drc и bdm27,28.

Отсутствие реакции на вибрационный стимул может указывать просто на гибель эмбрионов или серьезные нарушения жизненных функций из-за общей цитотоксичности, но также может отражать более специфическую токсичность, нацеленную на нейронные цепи восприятия стимула, интеграции и локомоторного выхода. Другими возможными сложными эффектами являются вмешательство в нервно-мышечный интерфейс или в мышечную структуру и функцию. Чтобы различить эти возможности, необходимы дополнительные анализы. Например, структурная целостность мышц может быть оценена с помощью анализа двойного лучепреломления58,59, а трансгенные линии доступны для оценки пертурны мышечной и нервной функции60,61. Тем не менее, записанные видеоданные уже позволяют более детально проанализировать морфологию и поведенческую реакцию эмбрионов, что может дать первую дополнительную информацию. Нарушен ли только С-образный изгиб или вся подвижность? Присутствуют ли еще остатки нервно-мышечной активности, на что указывают слабые или дрожащие движения хвоста? Сопровождается ли такое измененное поведение изменениями в морфологии, такими как отеки или повышенная кривизна тела? Кроме того, могут быть оценены такие параметры, как время задержки до С-образного изгиба или расстояние, пройденное во время escape-отклика (см., например, Ref. 44).

Описанный здесь протокол скрининга позволяет проводить быструю и надежную оценку токсичности соединений, а также специфическое выявление нелетальных нейротоксических, ототоксических и миотоксических соединений. Предоставленный рабочий процесс анализа прост в реализации и обеспечивает надежное считывание данных. Модификации стимульных протоколов, используемых в анализе вибрационного испуга, были использованы для изучения сложных эффектов на более сложные аспекты поведения при испуге, такие как предимпульсное торможение (ИПП)39,44 и привыкание32,33, и могут быть адаптированы к настройке стимулов на основе электродинамического преобразователя, используемой в этом исследовании.

Основным применением скрининговых систем на основе реакции испуга является оценка эффектов соединений в химических скринингах, что имеет значение как для оценки токсичности для человека, так и для разработки лекарств 1,4,62. В то же время, при тестировании ранних стадий жизни водного организма полученные результаты имеют непосредственное отношение к оценке экотоксикологического риска63,64. Кроме того, системы реакции на испуг могут быть использованы для поведенческого фенотипирования в генетических скринингах 65,66,67,68,69. Наша легко внедряемая и адаптируемая система обеспечивает доступную настройку для небольших лабораторий, намеревающихся проводить свои собственные проекты скрининга в этих различных областях применения.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы с благодарностью отмечаем отличную техническую помощь вспомогательного персонала рыбокомплекса IBCS-BIP и центра скрининга. Эта работа получила финансирование в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 965406 (PrecisionTox). Эти выходные данные отражают только точку зрения авторов, и Европейский Союз не может нести ответственность за любое использование содержащейся в них информации.

Materials

Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm Sigma-Aldrich Z289744-1EA Or comparable material
High-speed camera XIMEA  MQ013MG-ON USB 3 
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap VWR 215-3261 Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL SARSTEDT 70.3010.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL SARSTEDT 70.3050.100 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL SARSTEDT 70.3020.210 Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL SARSTEDT 70.3030.100 Or comparable material
Serological pipette 10 mL SARSTEDT 86.1254.001 Or comparable material
Serological pipette 25 mL SARSTEDT 86.1685.001 Or comparable material
Serological pipette 5 mL SARSTEDT 86.1253.001 Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) Greiner bio-one 628102 Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) SARSTEDT 83.3902.500 Or comparable material
Transfer pipette 6 mL SARSTEDT 86.1175 Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP SARSTEDT 62.554.502 Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP SARSTEDT 62.5472.54 Or comparable material
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  4. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  5. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2013).
  6. OECD. Test No. 250: EASZY assay – Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2021).
  7. Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
  8. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
  9. Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
  10. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  11. Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
  12. Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
  13. Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments–a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
  14. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
  15. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
  16. Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
  17. Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
  18. Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
  19. Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
  20. Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
  21. van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
  22. Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
  23. Marcato, D. . Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , (2018).
  24. PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
  25. Nüsslein-Volhard, C. . Zebrafish – A Practical Approach. , (2002).
  26. Berthold, M. R., Preisach, C. h. r. i. s. t. i. n. e., Burkhardt, H. a. n. s., Schmidt-Thieme, L. a. r. s., Decker, R. e. i. n. h. o. l. d., et al. . Data Analysis, Machine Learning and Applications. , (2008).
  27. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
  28. Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
  29. Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
  30. Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
  31. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
  32. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  33. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
  34. Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
  35. Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
  36. Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
  37. Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
  38. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  39. Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
  40. Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
  41. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
  42. Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
  43. Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
  44. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
  45. Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
  46. Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
  47. Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
  48. Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
  49. Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
  50. Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
  51. Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
  52. Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
  53. OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2019).
  54. Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
  55. Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
  56. van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
  57. van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
  58. Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
  59. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  60. Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
  61. Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
  62. Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
  63. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment–applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  64. Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
  65. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  66. Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
  67. Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
  68. Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
  69. Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).

Tags

ZebrafishVibration Startle ResponseToxicity ScreeningNeuromuscular ToxicityBehavioral AssayHigh-throughput ScreeningChemical Compound EvaluationPrecisionTox ConsortiumOMICS DataToxicity PathwaysBiomarkersHuman Toxicity Prediction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hayot, G., Marcato, D., Cramer von Clausbruch, C. A., Pace, G., Strähle, U., Colbourne, J. K., Pylatiuk, C., Peravali, R., Weiss, C., Scholz, S., Dickmeis, T. Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System. J. Vis. Exp. (203), e66153, doi:10.3791/66153 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image