Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi
Summary
Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.
Abstract
Kalsiyum sinyali, hemen hemen her dokunun ayrılmaz bir düzenleyicisidir. Bağırsak epiteli içinde kalsiyum, salgı aktivitesinin, aktin dinamiklerinin, inflamatuar yanıtların, kök hücre proliferasyonunun ve diğer birçok karakterize edilmemiş hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyal dinamiklerinin haritalanması, homeostatik hücresel süreçler hakkında fikir verebilir ve çeşitli uyaranlara benzersiz tepkileri ortaya çıkarabilir. İnsan bağırsak organoidleri (HIO’lar), bağırsak epitelini incelemek için yüksek verimli, insan kaynaklı bir modeldir ve bu nedenle kalsiyum dinamiklerini araştırmak için yararlı bir sistemi temsil eder. Bu makale, HIO’ları genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler) ile kararlı bir şekilde dönüştürmek, canlı floresan mikroskobu gerçekleştirmek ve kalsiyum sinyallerini anlamlı bir şekilde karakterize etmek için görüntüleme verilerini analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Temsili bir örnek olarak, 3 boyutlu HIO’lar, yeşil floresan protein bazlı sitozolik bir GECI olan GCaMP6’ları stabil bir şekilde eksprese etmek için lentivirüs ile dönüştürüldü. Tasarlanan HIO’lar daha sonra tek hücreli bir süspansiyona dağıtıldı ve tek katmanlar olarak tohumlandı. Farklılaşmadan sonra, HIO tek tabakaları rotavirüs ile enfekte edildi ve/veya kalsiyum yanıtını uyardığı bilinen ilaçlarla tedavi edildi. Sıcaklık kontrollü, nemlendirilmiş canlı görüntüleme odası ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu, enfekte olmuş veya ilaçla tedavi edilmiş tek tabakaların uzun süreli görüntülenmesine izin verdi. Görüntülemenin ardından, elde edilen görüntüler ücretsiz olarak kullanılabilen analiz yazılımı ImageJ kullanılarak analiz edildi. Genel olarak, bu çalışma HIO’larda hücresel sinyallemeyi karakterize etmek için uyarlanabilir bir boru hattı oluşturur.
Introduction
Kalsiyum, hücresel fizyolojinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynayan, yaygın olarak korunan ikinci bir habercidir1. Güçlü yükü, küçük boyutu ve fizyolojik koşullarda yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, kalsiyum, protein konformasyonunun ideal bir manipülatörüdür. Bu, kalsiyumu elektrokimyasal sinyalleri enzimatik, transkripsiyonel veya transkripsiyon sonrası değişikliklere dönüştürmek için güçlü bir araç haline getirir. Endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membranları boyunca katı kalsiyum konsantrasyonu gradyanları, sitozolik kalsiyum konsantrasyonunda hızlı değişikliklere izin veren yüksek bir itici güç oluşturur. Hem arabelleğe alma hem de aktif aktarım dahil olmak üzere birden çok mekanizma bu gradyanı sıkı bir şekilde korur. Normal hücresel fonksiyonlar için gerekli olsa da, bu bakım enerjik olarak pahalıdır ve bu da onu stres durumlarında özellikle duyarlı hale getirir 2.
Bu nedenle, sitozol içindeki kalsiyumun düzensizliği, birçok hücresel stres türünün neredeyse evrensel bir sinyalidir. Metabolik bozukluklar, toksinler, patojenler, mekanik hasar ve genetik bozulmaların tümü kalsiyum sinyalini bozabilir. Uyarandan bağımsız olarak, tüm hücre düzeyinde, sitozolik kalsiyumdaki sürekli, kontrolsüz artışlar apoptozu ve sonunda nekrozu teşvik edebilir 3,4. Bununla birlikte, daha düşük genlikli veya daha yüksek frekanslı sitozolik kalsiyum seviyelerindeki değişikliklerin değişen etkileri vardır2. Benzer şekilde, kalsiyum dalgalanmalarının sonuçları, meydana geldikleri uzamsal mikro alana bağlı olarak farklılık gösterebilir5. Bu nedenle kalsiyum seviyelerinin izlenmesi, dinamik sinyalleme süreçleri hakkında fikir verebilir, ancak bu, nispeten yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip örnekleme gerektirir.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri (GECI’ler), canlı hücre sistemlerinde sürekli örnekleme için güçlü araçlardır6. En yaygın kullanılan GECI’lerden bazıları, GCaMPs7 olarak bilinen GFP bazlı kalsiyuma duyarlı floresan proteinlerdir. Kanonik GCaMP, üç farklı protein alanının bir birleşimidir: dairesel olarak permütasyonlu bir GFP (cpGFP), kalmodulin ve M136. Kalmodulin alanı, kalsiyumun bağlanması üzerine bir konformasyon değişikliğine uğrar ve M13 ile etkileşimine izin verir. Kalmodulin-M13 etkileşimi, cpGFP’de, uyarma üzerine floresan emisyonunu artıran konformasyonel bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, kalsiyum konsantrasyonundaki bir artış, GCaMP floresan yoğunluğundaki bir artışla ilişkilidir. Bu sensörler sitozolik olabilir veya belirli organellerihedefleyebilir 8.
Çoğu dokuya benzer şekilde, kalsiyum gastrointestinal epitel içindeki çeşitli işlevleri düzenler. Bağırsak epiteli, besin ve sıvı emilimi için ayrılmaz bir parçadır, ancak aynı zamanda patojen istilasını veya toksik hakaretleri önlemek için sıkı bir bariyer ve bağışıklık arayüzü oluşturmalıdır. Kalsiyuma bağımlı yollar bu hayati fonksiyonların neredeyse tamamını etkiler 9,10,11. Bununla birlikte, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyali, terapötik bir hedef olarak umut verici potansiyele sahip, yeterince keşfedilmemiş bir sınır olmaya devam etmektedir. Bağırsak epitelindeki kalsiyum dinamiklerinin in vivo olarak izlenmesi zorluklar sunmaya devam ederken, insan bağırsak organoidleri (HIO’lar) deney için uyarlanabilir bir ex vivo sistem sunar12. HIO’lar, insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen 3 boyutlu (3D) sferoidlerdir ve farklılaşma üzerine, doğal bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğinin çoğunu özetler12.
Bu protokol, GECI’leri eksprese eden HIO’ları tasarlamak ve daha sonra tasarlanmış HIO’ları canlı hücreli kalsiyum görüntüleme için tek katmanlar olarak hazırlamak için kapsamlı yöntemleri açıklar. Kalsiyum sinyalizasyonunu bozan patolojik bir manipülasyon örneği olarak viral enfeksiyonu sunar ve bu değişiklikleri ölçmek için analitik bir yaklaşım sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sitozolik Ca2+ seviyelerindeki değişiklikler,epitel 10,16,17 içindeki patolojilerin hem nedeni hem de sonucu olabilir. Sitozolik kalsiyumdaki artışlar, kalsiyuma bağımlı klorür kanalının aktivasyonu yoluyla doğrudan sekresyona neden olabilirTMEM16A 18,19. Ca2+‘ya yanıt olarak TMEM16A aktivasyonu, apikal klorür akışına izin vererek, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (NIH) R01DK115507 ve R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) hibeleri ile desteklenmiştir. Stajyer desteği, NIH hibe F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F.J. Scribano) ve F32DK130288 (PI: K.A. Engevik) tarafından sağlandı. Organoid bakım ortamını sağladığı için Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Enteroid Çekirdeğine teşekkür ederiz.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
