CRISPR-Cas9 Adeno-İlişkili Virüs (AAV) ve 2 Hücreli Embriyo Elektroporasyonu Kullanılarak Sıçan Embriyolarının Genom Düzenlemesi
Summary
Bu protokol, genetiği değiştirilmiş sıçan modelleri üretmek için optimize edilmiş bir yaklaşım sunar. Adeno-ilişkili virüs (AAV), bir DNA onarım şablonu sunmak için kullanılır ve elektroporasyon, 2 hücreli embriyoda genom düzenleme işlemini tamamlamak için CRISPR-Cas9 reaktiflerini iletmek için kullanılır.
Abstract
Genom düzenleme teknolojisi, sıçanlar da dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş hayvanlar üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. DNA onarım şablonlarının ve CRISPR-Cas reaktiflerinin sitoplazmik veya pronükleer enjeksiyonu, embriyolara en yaygın dağıtım yöntemidir. Bununla birlikte, bu tür bir mikromanipülasyon, özel ekipmana erişim gerektirir, zahmetlidir ve belirli bir düzeyde teknik beceri gerektirir. Ayrıca, mikroenjeksiyon teknikleri genellikle embriyo üzerindeki mekanik stres nedeniyle daha düşük embriyo sağkalımına neden olur. Bu protokolde, mikroenjeksiyona gerek kalmadan CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi ile birlikte çalışacak büyük DNA onarım şablonları sunmak için optimize edilmiş bir yöntem geliştirdik. Bu protokol, 2 hücreli embriyoları modifiye etmek için elektroporasyon yoluyla CRISPR-Cas9 ribonükleoproteininin (RNP) verilmesi ile birlikte tek sarmallı DNA donör şablonlarının AAV aracılı DNA iletimini birleştirir. Bu yeni stratejiyi kullanarak, %42 ile %90 arasında verimlilikle 1.2 ila 3.0 kb boyutlarında DNA dizilerinin eklenmesini taşıyan hedefli knock-in sıçan modellerini başarıyla ürettik.
Introduction
CRISPR tabanlı genom düzenleme araçlarının geliştirilmesi, yeni ve daha karmaşık genetiği değiştirilmiş sıçan modellerini verimli bir şekilde üretme yeteneğimizi hızlandırdı. Tek kılavuzlu RNA, Cas9 nükleaz ile birlikte, genom içindeki ilgilenilen DNA dizilerini hedefleyen ve çift sarmallı DNA kırılmalarına neden olan Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri oluşturmak üzere birleştirilir. Hücresel DNA onarım mekanizmaları hataya açık olduğundan, onarım işlemi sırasında hedef genin işlevini bozabilecek eklemeler ve silmeler (INDEL’ler) ortaya çıkar. Genom düzenleme reaktifleri ile birlikte istenen bir tasarlanmış DNA dizisinin (onarım şablonu) birlikte verilmesi durumunda, onarım şablonunun çift sarmallı DNA kırılmasını içeren bölgeye eklenmesi, homolojiye yönelik onarım (HDR) adı verilen bir işlemle gerçekleşir. Bu, hedeflenen DNA eklemeleri/ikameleri (knock-in’ler) ile hayvan modelleri oluşturmak için etkili bir stratejidir. Bir sınırlama, knock-in dizilerinin genellikle büyük boyutlu olmasıdır, bunun gen düzenleme verimliliğini azalttığı ve böylece istenen modelin oluşturulmasını daha zor hale getirdiği gösterilmiştir1. Zincirleme verimliliği artırmaya yönelik stratejiler, hem çift sarmallı DNA (dsDNA) hem de tek sarmallı DNA (ssDNA) onarım şablonlarının doğrusallaştırılmasını ve DNA onarım şablonlarının kimyasal modifikasyonunuiçermektedir 2,3,4. Ek olarak, HDR uyarıcı bileşiklerle birlikte pronükleer mikroenjeksiyon, mikroenjeksiyon ile birlikte elektrik darbelerinin uygulanması ve 2 hücreli embriyolara zamanlanmış mikroenjeksiyon denenmiştir 5,6,7. Bu yaklaşımların bazılarının başarısına rağmen, 1.0 kb’den daha büyük DNA dizilerinin dahil edilmesi teknik olarak zor olmaya devam etmektedir.
Reaktifleri kültürlenmiş hücre hatlarına sokmak için yaygın bir yöntem olan elektroporasyon, CRISPR-Cas9 bileşenlerini embriyolara vermek için mikroenjeksiyona bir alternatif sunar. İlk olarak sıçan embriyolarında8 gösterilen embriyo elektroporasyonu, o zamandan beri farelerde 9,10,11,12,13, domuzlarda14,15 ve diğer hayvan model organizmalarında 16,17,18 bir dağıtım yöntemi olarak başarıyla kullanılmıştır.. CRISPR-Cas9 reaktifleri içeren ortamda süspanse edilen embriyolar, iki elektrot arasında bir küvete veya bir cam slayt üzerine yerleştirilir ve doğrudan elektrik akımı darbelerine maruz bırakılır. Bu, CRISPR-Cas9 bileşenlerinin embriyolara girdiği zona pellucida ve embriyo plazma zarında geçici açıklıklar oluşturur. Tipik olarak, geçici açıklıkları oluşturmak için orta seviyeli elektriksel “gözenek” darbeleri kullanılır, ardından negatif yüklü genom düzenleme bileşenlerinin hareketini kolaylaştıran daha düşük seviyeli elektriksel “transfer darbeleri” gelir. Embriyo elektroporasyonu verimlidir, yüksek verime sahiptir ve gerçekleştirilmesi kolaydır. Bununla birlikte, embriyo elektroporasyonunun küçük (<200 bp) ssDNA onarım şablonlarının tanıtımı için oldukça başarılı olduğu gösterilmiş olsa da, daha büyük (>1.0 kb) onarım şablonlarının başarılı elektroporasyonuna dair çok az rapor vardır13,19. Bu boyut kısıtlaması, büyük yerleştirmeler gerektiren knock-in hayvan modelleri oluşturmak için embriyo elektroporasyonunun önemli bir sınırlamasını temsil eder.
Gen terapisi bağlamında, adeno-ilişkili virüsler (AAV’ler), hem bölünen hem de bölünmeyen hücrelerin in vivo enfektivitesi, patojenite eksikliği ve nadir genomik entegrasyon nedeniyle genetik materyali iletmek için uzun süredir araç olarak kullanılmaktadır20,21. Son zamanlarda, daha fazla çalışma, DNA onarım şablonlarını ve CRISPR reaktiflerini tanıtmak için AAV’leri CRISPR-Cas9 teknolojisiyle birleştirdi 22,23,24. Bu yaklaşım, mikroenjeksiyon tekniklerine ihtiyaç duymadan daha büyük DNA onarım şablonlarının sunulmasına izin verir.
HDR yolu, hücre döngüsünün geç S ve G2 fazlarında daha aktiftir25,26. İn vitro olarak yapılan çalışmalarda, CRISPR-Cas9 RNP’lerinin ve DNA onarım şablonlarının G2 ile senkronize hücrelere verilmesi veya Cas9 proteininin varlığının bir Cas9-Geminin füzyon proteini2 kullanılarak geç S ve G2 fazlarına kısıtlanmasıyla zincirleme verimlilikte önemli artışlar elde edilmiştir. Ayrıca, 2 hücreli aşama embriyosunun genişletilmiş G2 fazı sırasında meydana gelen büyük bir zigotik genom aktivasyonu (ZGA) olayı vardır ve bu, açık bir kromatin durumu ile ilişkilidir. Bunun, CRISPR-Cas9 RNP’lerine ve onarım şablonlarına genomik DNA’ya daha fazla erişilebilirlik sağladığı tahmin edilmektedir.
Amacımız, embriyo gelişiminin 2 hücreli aşamasında CRISPR-Cas9 RNP’leri tanıtmak için AAV yaklaşımını embriyo elektroporasyonu ile birleştirerek tüm bu gözlemleri geliştirmekti. Bu strateji, DNA eklemelerinin hedeflenen genetik mühendisliği için etkili bir yöntem oluşturmak için AAV’nin daha büyük DNA onarım şablonu dağıtım kapasitesinden, elektroporasyonun teknik kolaylığından ve embriyo gelişimi sırasında genomik erişilebilirlik için daha uygun 2 hücreli zaman noktasından yararlanır. Bu protokolde vurgulandığı gibi, optimize edilmiş yöntemimiz, mikroenjeksiyon tekniklerine ihtiyaç duymadan 1.2 ila 3.0 kb boyutunda DNA dizilerinin eklenmesini taşıyan hedefli knock-in sıçan modellerinin üretilmesine izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas genom düzenleme sistemi, çeşitli hayvan türlerinde hem basit hem de karmaşık, özelleştirilmiş genetik modifikasyonların verimli bir şekilde üretilmesine izin vererek genetik mühendisliği alanında devrim yarattı. Genom düzenleme ile ilgili tekniklerde sık sık yapılan iyileştirmeler ve iyileştirmeler, çok yönlülüğünü daha da artırmaktadır. Burada, CRISPR-Cas9 reaktiflerinin 2 hücreli kemirgen embriyolarına 2 hücreli embriyo elektroporasyonu ile birlikte ssAAV aracılı DNA ileti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, videografi ve video düzenleme konusundaki yardımları için Nolan Davis’e teşekkür eder.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
