Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos
Summary
Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.
Abstract
Os neutrófilos são células de linhagem mieloide que formam uma parte crucial do sistema imune inato. A última década revelou papéis chave adicionais que os neutrófilos desempenham na patogênese do câncer, doenças autoimunes e várias condições inflamatórias agudas e crônicas, contribuindo para o início e perpetuação da desregulação imunológica por meio de múltiplos mecanismos, incluindo a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que são estruturas cruciais na defesa antimicrobiana. Limitações nas técnicas para quantificar a formação de NET de forma imparcial, reprodutível e eficiente têm restringido nossa capacidade de entender melhor o papel dos neutrófilos na saúde e nas doenças. Descrevemos um método automatizado, em tempo real e de alto rendimento para quantificar neutrófilos submetidos à formação de NET usando uma plataforma de imagem de células vivas acoplada a uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana usando dois corantes de DNA diferentes para obter imagens de DNA intracelular e extracelular. Essa metodologia é capaz de ajudar a avaliar a fisiologia dos neutrófilos e testar moléculas que podem ter como alvo a formação de NET.
Introduction
Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas de cromatina semelhantes a teias extrudadas de neutrófilos em resposta a vários estímulos inflamatórios. As NETs são compostas por DNA, histonas e várias proteínas/peptídeos antimicrobianos, que aprisionam e matam patógenos infecciosos e invocam respostas inflamatórias1.
Embora os TNEs sejam benéficos para a defesa do hospedeiro contra patógenos, eles têm chamado a atenção como um potencial impulsionador de várias doenças autoimunes2, trombose3, doenças metabólicas4 e crescimento metastático de cânceres5. Como tal, a inibição da formação de NET é uma opção terapêutica potencial para estas doenças. No entanto, apesar de algumas moléculas promissoras de TNEs terem como alvo em desenvolvimento6, ainda não há uma terapia aprovada que afete especificamente esse mecanismo. Isso é, pelo menos parcialmente, atribuível à falta de métodos de quantificação objetivos, imparciais, reprodutíveis e de alto rendimento para a formação de NET.
Estabelecemos e relatamos um novo método utilizando uma plataforma de imagem de células vivas de duas cores 7,8. Imagens de lapso de tempo de neutrófilos corados com corante nuclear permeável à membrana e corante de DNA impermeável à membrana são analisadas pelo software, e os números de neutrófilos pré e pós-formadores de NETs são contados em vários pontos de tempo. Uma vez que a integridade da membrana plasmática é perdida durante a formação de NET pela regulação da desmontagem de Lamin B mediada por PKCα e Lamin A/C mediada por CDK4/69, os neutrófilos formadores de NET são corados por corante de DNA impermeável à membrana, enquanto os neutrófilos saudáveis não o são. Esse método supera os problemas das técnicas relatadas anteriormente para quantificar a formação de NET e fornece quantificação de NET imparcial, de alto rendimento, reprodutível e precisa de maneira automatizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos atuais para quantificar NETs ex vivo têm várias desvantagens que limitam nossa capacidade de estudar neutrófilos, NETs e potenciais alvos terapêuticos de forma imparcial e de alto rendimento10,14. Por exemplo, a contagem direta de células formadoras de NETs após a coloração por imunofluorescência, considerada o padrão-ouro para quantificação de NETs, é de baixo rendimento e dependente da visão subjetiva do operador. Um ensaio em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Seção de Imagem Leve do Escritório de Ciência e Tecnologia do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele do National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
