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生物化学

Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/66012
, , , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences,Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology,Korea University

Summary

Neste protocolo, métodos relevantes para metabolômica arteriovenosa otimizada para BAT usando GC-MS em um modelo de camundongo são descritos. Esses métodos permitem a aquisição de informações valiosas sobre a troca de metabólitos mediada por MTD em nível de organismo.

Abstract

O tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel crucial na regulação da homeostase metabólica através de um processo único de gasto energético conhecido como termogênese sem tremores. Para conseguir isso, a BAT utiliza um cardápio diversificado de nutrientes circulantes para suportar sua alta demanda metabólica. Além disso, a MTD secreta fatores bioativos derivados de metabólitos que podem servir como combustíveis metabólicos ou moléculas sinalizadoras, facilitando a comunicação intratecidual e/ou intertecidual mediada por BAT. Isso sugere que a MTD participa ativamente na troca de metabólitos sistêmicos, uma característica interessante que está começando a ser explorada. Aqui, apresentamos um protocolo para metbolômica arteriovenosa BAT otimizada em nível de camundongo in vivo . O protocolo se concentra em métodos relevantes para estimulações termogênicas e uma técnica de coleta de sangue arteriovenoso usando a veia de Sulzer, que drena seletivamente o sangue venoso interescapular derivado do BAT e o sangue arterial sistêmico. Em seguida, um protocolo metabolômico baseado em cromatografia gasosa usando essas amostras de sangue é demonstrado. O uso desta técnica deve expandir a compreensão da troca de metabólitos regulados por MTD em nível inter-órgão, medindo a captação líquida e liberação de metabólitos por BAT.

Introduction

O tecido adiposo marrom (BAT) possui uma propriedade única de gasto energético conhecida como termogênese sem tremores (NST), que envolve mecanismos dependentes da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UCP1) e independentes de UCP1 1,2,3,4,5. Essas características distintas implicam MTD na regulação do metabolismo sistêmico e na patogênese de doenças metabólicas, incluindo obesidade, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e caquexia por câncer 6,7,8. Estudos retrospectivos recentes têm demonstrado associação inversa entre massa de MTD e/ou sua atividade metabólica com obesidade, hiperglicemia e saúde cardiometabólica em humanos 9,10,11.

Recentemente, a MTD tem sido proposta como um sumidouro metabólico responsável pela manutenção do NST, uma vez que requer quantidades substanciais de nutrientes circulantes como combustível termogênico 6,7. Além disso, as MTD podem gerar e liberar fatores bioativos, denominados adipocinas marrons ou BATokines, que atuam como sinais endócrinos e/ou parácrinos, indicando seu envolvimento ativo na homeostase metabólica em nível de sistemas 12,13,14,15. Portanto, a compreensão do metabolismo de nutrientes da MTD deve melhorar nossa compreensão de seu significado fisiopatológico em humanos, além de seu papel convencional como órgão termorregulador.

Estudos metabolômicos empregando traçadores de isótopos estáveis, em combinação com estudos clássicos de absorção de nutrientes usando radiotraçadores não metabolizáveis, melhoraram significativamente nossa compreensão de quais nutrientes são preferencialmente absorvidos pela MTD e como são utilizados 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Por exemplo, estudos com traçadores radioativos demonstraram que a MTD ativada pelo frio absorve glicose, ácidos graxos ligados a lipoproteínas e aminoácidos de cadeia ramificada 16,17,18,19,20,21,22,23,27 . O recente rastreamento isotópico combinado com estudos metabolômicos tem permitido medir o destino metabólico e o fluxo desses nutrientes dentro dos tecidos e células cultivadas 24,25,26,28,29,30. No entanto, essas análises se concentram principalmente na utilização individual de nutrientes, deixando-nos com conhecimento limitado dos papéis de nível de sistemas da MTD na troca de metabólitos de órgãos. As questões relativas às séries específicas de nutrientes circulantes consumidos pelas MTD e às suas contribuições quantitativas em termos de carbono e azoto permanecem indefinidas. Além disso, a exploração de se a MTD pode gerar e liberar BATokines derivadas de metabólitos (por exemplo, lipocinas) usando nutrientes está apenas começando 12,13,14,15,31,32.

A análise arteriovenosa do sangue é uma abordagem fisiológica clássica utilizada para avaliar a captação ou liberação específica de moléculas circulantes em órgãos/tecidos. Esta técnica já foi aplicada à MTD interescapular de ratos para medir oxigênio e vários metabólitos, estabelecendo a MTD como o principal sítio de termogênese adaptativa com seu potencial catabólico 33,34,35,36,37. Recentemente, um estudo arteriovenoso utilizando MTD interescapular de ratos foi acoplado a uma abordagem trans-ômica, levando à identificação de BATokinas não descobertas liberadas por MTD estimulada termogenicamente38.

Avanços recentes em cromatografia gasosa de alta sensibilidade e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (GC-MS e LC-MS) têm reacendido o interesse em estudos arteriovenosos para a análise quantitativa da troca de metabólitos órgão-específicos 39,40,41. Essas técnicas, com seu alto poder de resolução e precisão de massa, permitem a análise abrangente de uma ampla gama de metabólitos usando pequenas quantidades de amostra.

Em alinhamento com esses avanços, um estudo recente adaptou com sucesso a metabolômica arteriovenosa para o estudo da MTD em camundongos, possibilitando a análise quantitativa das atividades de troca de metabólitos nas MTD em diferentes condições42. Este artigo apresenta um protocolo de metabolômica arteriovenosa direcionado para MTD usando GC-MS em um modelo de camundongo C57BL/6J.

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sungkyunkwan (IACUC). Os camundongos foram alojados em um biotério aprovado pela IACUC, localizado em uma sala limpa regulada para 22 °C e 45% de umidade, após um ciclo claro/escuro diário de 12 horas. Eles foram mantidos em racks ventilados e tiveram acesso a uma dieta padrão de ração ad libitum (composta por 60% de carboidratos, 16% de proteínas e 3% de gorduras). Os materiais de cam…

Representative Results

A Figura 1 ilustra o esquema experimental da metabolômica AV otimizada para BAT. Como mencionado na seção Protocolo, para obter tecido adiposo marrom diferencialmente estimulado, camundongos são submetidos à aclimatação à temperatura em incubadoras de roedores ou recebem administração farmacológica, como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, camundongos são anestesiados e amostras de sangue são coletadas para análise metabolômica (Figur…

Discussion

Um passo crítico na compreensão do potencial metabólico da MTD no balanço energético de todo o corpo é definir quais nutrientes ela consome, como eles são processados metabolicamente e quais metabólitos são liberados na circulação. Esse protocolo introduz uma técnica especializada em amostragem arteriovenosa que permite o acesso à vasculatura venosa das MTD interescapulares e da vasculatura arterial sistêmica em camundongos C57BL/6J, recentemente desenvolvida e validada por Park ecols.42</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos os membros dos laboratórios Choi e Jung pela discussão metodológica. Agradecemos a C. Jang e D. Guertin pelos conselhos e feedback. Agradecemos a M.S. Choi pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por NRF-2022R1C1C1012034 para S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 para D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 para S.M.J. e D.W.C. Este trabalho foi apoiado pela Chungnam National University for W.T.K. A Figura 1 e a Figura 2 foram criadas usando BioRender (http://biorender.com/).

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C
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Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).
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