活小鼠精子顶体钙动力学和胞吐作用的实时成像

精子在称为获能¹ 的过程中获得受精能力。这个过程的一个终点是精子获得经历AE的能力。超过二十年的数据支持哺乳动物精子中存在复杂的多步骤AE模型（^总结于2,3）。然而，研究活精子中的AE具有挑战性，目前可用的以足够分辨率监测这一过程的方法很麻烦，需要多个制备步骤⁴，仅限于检测AE的最后一步（例如，使用PNA⁵），仅限于测量胞质钙的变化（与顶体钙动力学相反）， 或仅限于细胞溶质钙动力学或 AE⁶ 的测量。

为了克服生理条件下实时AE研究的一些关键局限性，并能够研究钙动力学和AE之间的相互作用，生成了一个独特的小鼠模型。在该小鼠模型中，由基因编码的 Ca²⁺ 传感器 （GCaMP3） 和 mCherry 组成的融合蛋白被表达并使用 acrosin 启动子和信号转导肽² 靶向顶体。靶向双GCaMP3-mCherry传感器能够使用显微镜和单细胞兴奋剂递送系统，在生理条件下同时实时测量活精子中的钙浓度和顶体内容物状态（图1）。作为顶体基质的一个组成部分，膜融合和 AE 将导致精子中光稳定和 pH 不敏感的 mCherry 荧光丢失，因为这种蛋白质从顶体囊泡中扩散出来。在这方面，该模型反映AE的时间和发生的能力类似于顶体靶向GFP小鼠^系7,8,9的益处。

该转基因小鼠品系中使用的 GCaMP3 变体的 KD 约为 400 μM，Ca²⁺ 的动态范围为 10-4-10-3 M¹⁰，适用于该囊泡。我们发现，GCaMP3 的这种特征组合可以揭示质膜和顶体外膜 （OAM） 之间的融合孔形成²。融合孔检测是由于孔径太小而无法使 AcroSensE 蛋白从顶体中分散出来（通过顶体内容物丢失），同时提供膜“通道”，使 Ca²⁺ 离子能够流入顶体腔，导致 GCaMP3 的荧光强度增加。

明亮的、单体的、非钙敏感的荧光蛋白mCherry支持顶体的可视化，而GCaMP3信号微弱（例如，在Ca²⁺ 结合之前， 图2），重要的是，它还允许识别适合成像的顶体完整精子细胞。

以下协议描述了独特的AcroSensE小鼠模型的利用以及实验中使用的显微镜方法，以高空间和时间分辨率研究AE和精子钙动力学。