구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법
Summary
이 프로토콜은 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 항균 광역학 요법(aPDT)의 적용을 설명합니다. aPDT는 커큐미노이드와 청색 LED 조명의 수용성 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.
Abstract
항균 광역학 요법(aPDT)은 체외에서 광범위하게 조사되었으며, 감염의 전임상 동물 모델은 임상 시험 전에 대체 치료법을 평가하는 데 적합합니다. 이 연구는 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 aPDT의 효능을 설명합니다. 40마리의 마우스에게 프레드니솔론(prednisolone)을 피하 주사하여 면역을 억제하고, C. 알비칸스(C. albicans) 세포 현탁액에 미리 담근 구강 면봉을 사용하여 혀를 접종하였다. 테트라사이클린은 실험 과정에서 식수를 통해 투여되었습니다. 진균 접종 5일 후, 마우스는 무작위로 8개 그룹으로 분포되었습니다. 치료되지 않은 감염되지 않은 마우스의 아홉 번째 그룹은 음성 대조군으로 포함되었습니다(n=5). 커큐미노이드 혼합물의 세 가지 농도(20μM, 40μM 및 80μM)를 청색 LED 조명(89.2mW/cm2; ~455nm)과 조명 없음(각각 C+L+ 및 C+L- 그룹)으로 테스트했습니다. 가벼운 단독(C-L+), 무처리(C-L-), 감염되지 않은 동물을 대조군으로 평가했습니다. 데이터는 Welch의 ANOVA 및 Games-Howell 검정(α=0.05)을 사용하여 분석되었습니다. 구강 칸디다증은 감염된 모든 동물에서 확립되었으며 혀의 등쪽에 특징적인 흰색 반점 또는 가성막의 존재를 통해 거시적으로 시각화되었습니다. 조직병리학적 절편은 C-L-그룹 내 상피의 각질화된 층에 국한된 효모와 필라멘트의 다량의 존재를 확인했으며, 40μM 또는 80μM 커큐미노이드를 사용하여 aPDT를 투여한 마우스에서 얻은 이미지에서 진균 세포의 존재가 시각적으로 감소했습니다. 80μM 커큐미노이드에 의해 매개된 aPDT는 C-L-그룹에 비해 콜로니 수가 2.47 log10 감소하는 것을 촉진했습니다(p=0.008). 다른 모든 그룹은 광감작제(C+L-) 또는 빛 단독(C-L+) 그룹을 포함하여 콜로니 수에서 통계적으로 유의한 감소를 보이지 않았습니다. 커큐미노이드 매개 aPDT는 쥐의 혀에서 나오는 곰팡이 부하를 줄였습니다.
Introduction
구강 칸디다증(OC)은 구강의 주요 곰팡이 감염입니다. 그것은 칸디다 종(Candida spp)의 과잉 증식으로 인해 발생합니다. 난소염의 발병 원인으로는 내분비 기능 장애, 광범위 항생제 사용, 방사선 및 화학 요법, 영양 결핍, 구강 건조증(낮은 타액 흐름), 의치 사용, 위생 불량, 특히 면역 억제등이 있다 1. 칸디다 종 중에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans )가 가장 널리 퍼져 있고 독성이 강합니다. 그것은 인체에서 공생 종으로 발견되며 기회 병원체로 발견됩니다. C. albicans 는 공생 효모(blastopores)에서 병원성 필라멘트(균사 및 pseudohyphae)로 형태를 변경할 수 있는 능력이 있습니다.2. 사상체, 특히 균사는 세포내이입(endocytosis) 또는 능동적 침투를 통해 숙주 상피에 침입하여 감염을 일으킬 수 있다3. 알비칸스(C. albicans )의 다른 독성 인자로는 리파아제(lipase), 포스포리파제(phospholipase), 단백질 분해 효소(proteinase), 칸디다리신(candidalysin)과 같은 지방 분해 및 가수분해 효소 및 독소의 부착, 생물막 형성, 분비 등이 있다4.
OC 치료에는 항진균제, 특히 국소 폴리엔 및 아졸(니스타틴 및 미코나졸)의 사용이 포함됩니다5. 그러나 단기적인 효능만 보이며 재발이 잦다. 또한 항진균제의 남용은 항진균제 내성 발달 및 확산 문제를 야기하고있다 6. 따라서 산소가 있는 상태에서 적절한 파장(PS 흡수와 동일)에서 광감작제(PS)와 빛을 결합하는 항균 광역학 요법(aPDT)과 같은 대체 요법이 필요합니다. PS는 세포에 결합하거나 세포에 흡수되며, 빛에 의해 활성화되면 감작된 세포에 독성이 있는 활성산소종(ROS)을 생성한다7.
aPDT에서 사용되는 광감작제(PSs) 중 하나는 강황 식물(Curcuma longa L.)의 뿌리줄기에서 추출한 자연 발생 화합물인 커큐민(CUR)입니다. 커큐민은 항염증, 항산화, 항암 및 항균 기능을 포함한 수많은 치료 특성을 가지고 있습니다 8,9. 선행 조사에 따르면 CUR을 활용한 aPDT는 숙주의 조직에 해를 끼치지 않으면서 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 C. 알비칸스를 효과적으로 감소시켰다10. CUR은 강황에서 추출한 주요 커큐미노이드이지만 데메톡시커큐민 및 비스-데메톡시커큐민과 같은 다른 폴리페놀도 이 식물에서 발견됩니다. 커큐미노이드 매개 aPDT는 카테터에서 성장한 황색포도상구균의 생물막에 대한 항균 활성을 입증했다11. 그러나 우리가 아는 한, C. albicans에 대한 항진균 활성은 불분명합니다. 따라서 이 연구에서는 OC의 쥐 모델에서 C. albicans에 대해 커큐미노이드 염에 의해 매개되는 aPDT를 평가했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. 알비칸스(C. albicans)는 면역 저하 상태, 진성 당뇨병, 항생제 장기간 사용, 구강 위생 불량 등의 구강 및 식도 감염과 관련이 있다 1,3. 인간 감염성 질환 연구는 임상시험을 안전하고 정확하게 설계하기 전에 체외 및 생체 내 조사가 모두 필요합니다. 본 연구는 C. albicans에 의한 구강 감염의 발병기전과 항진균제 접근법의 효능…
Acknowledgements
저자들은 FAPESP(São Paulo Research Foundation, 프로세스 번호 FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) 및 2008/00601-6)의 재정적 지원에 감사를 표합니다. 또한 CUR 기반 수용성 염에 대한 정보를 제공해 주신 Ana Paula Silva 박사님께도 감사드립니다.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
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