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生物化学

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Abstract

Solute Carrier (SLCs) sind Membrantransporter, die eine Reihe von endogenen und exogenen Substraten importieren und exportieren, darunter Ionen, Nährstoffe, Metaboliten, Neurotransmitter und Pharmazeutika. Obwohl sich diese Gruppe von Proteinen als attraktive therapeutische Ziele und Marker für Krankheiten erwiesen hat, wird sie von den derzeitigen Pharmazeutika immer noch relativ wenig unter Drogen gesetzt. Wirkstoffforschungsprojekte für diese Transporter werden durch begrenztes strukturelles, funktionelles und physiologisches Wissen behindert, was letztendlich auf die Schwierigkeiten bei der Expression und Reinigung dieser Klasse von membraneingebetteten Proteinen zurückzuführen ist. Hier demonstrieren wir Methoden, um hochreine Milligramm-Mengen von humanen SLC-Transporterproteinen unter Verwendung von Codon-optimierten Gensequenzen zu erhalten. In Verbindung mit einer systematischen Untersuchung des Konstruktdesigns und der Hochdurchsatzexpression stellen diese Protokolle die Erhaltung der strukturellen Integrität und biochemischen Aktivität der Zielproteine sicher. Wir beleuchten auch kritische Schritte in der eukaryotischen Zellexpression, der Affinitätsreinigung und der Größenausschlusschromatographie dieser Proteine. Letztendlich führt dieser Arbeitsablauf zu reinen, funktionell aktiven und stabilen Proteinpräparaten, die sich für hochauflösende Strukturbestimmungen, Transportstudien, niedermolekulare Engagement-Assays und In-vitro-Screenings mit hohem Durchsatz eignen.

Introduction

Membranproteine sind seit langem Ziele für Forscher und Pharmaindustrie gleichermaßen. Bei den Solute Carriers (SLCs) handelt es sich um eine Familie von über 400 sekundären Transportergenen, die im menschlichen Genom kodiert sind1. Diese Transporter sind am Import und Export zahlreicher Moleküle beteiligt, darunter Ionen2, Neurotransmitter3, Lipide 4,5,6,7, Aminosäuren8, Nährstoffe9,10,11 und Pharmazeutika 12. Mit einer solchen Breite von Substraten sind diese Proteine auch an einer Reihe von Pathophysiologien durch den Transport von Toxinen13, den Transport und die Hemmung durch Missbrauchsdrogen 14,15 oder schädliche Mutationen16 beteiligt. Bakterielle Homologe dienten als Prototypen für den grundlegenden Transportmechanismus mehrerer SLC-Familien 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Im Gegensatz zu humanen Proteinen werden prokaryotische Orthologe oft besser im gut verstandenen Escherichia coli-Expressionssystemexprimiert 26,27 und sind stabiler in den kleineren Detergenzien, die wohlgeordnete Kristalle für die Röntgenkristallographie liefern 28. Sequenzelle und funktionelle Unterschiede erschweren jedoch die Verwendung dieser entfernt verwandten Proteine für die Wirkstoffforschung29,30. Folglich ist oft eine direkte Untersuchung des menschlichen Proteins erforderlich, um den Wirkmechanismus von Medikamenten zu entschlüsseln, die auf SLCs abzielen 31,32,33,34,35. Während die jüngsten Fortschritte in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) die strukturelle Charakterisierung von SLCs unter nativeren Bedingungen ermöglicht haben36,37, bleibt die Schwierigkeit bei der Expression und Reinigung dieser Proteine eine Herausforderung für die Entwicklung zielgerichteter Therapeutika und Diagnostika.

Um diese Herausforderung zu bewältigen, hat das RESOLUTE-Konsortium (re-solute.eu) Ressourcen und Protokolle für die großflächige Expression und Reinigung von humanen Proteinen der SLC-Familie entwickelt38. Ausgehend von Codon-optimierten Genen haben wir Methoden für das Hochdurchsatz-Klonen und Screening von SLC-Konstrukten entwickelt. Diese Methoden wurden systematisch auf die gesamte Familie der SLCs angewendet, die Gene wurden in das virale Expressionssystem BacMam kloniert und die Proteinexpression wurde in humanen Zelllinien39 getestet, basierend auf zuvor beschriebenen Methoden für Hochdurchsatz-Klonierung und Expressionstests40. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das SLC-Gen aus dem pDONR221-Plasmid in einen pHTBV1.1-Vektor kloniert wird. Dieses Konstrukt wird anschließend verwendet, um das interessierende Gen in einen Bacmid-Vektor für die Transfektion von Insektenzellen zu transponieren, der einen Cytomegalievirus-Promotor und Enhancer-Elemente für die Expression in Säugetierzellen enthält. Das resultierende Baculovirus kann verwendet werden, um Säugetierzellen für die Expression des Ziel-SLC-Proteins zu transduzieren.

Wir haben standardisierte Methoden für die großtechnische Expression und stabile Aufreinigung ausgewählter SLCs weiterentwickelt (Abbildung 1). Dieses Protokoll enthält mehrere Prüfpunkte, um eine effektive Fehlerbehebung zu erleichtern und die Variabilität zwischen den Experimenten zu minimieren. Insbesondere die routinemäßige Überwachung der Proteinexpression und -lokalisierung sowie die Optimierung der Reinigungsbedingungen für einzelne Ziele in kleinem Maßstab wurden durch Streptokokken- und grün fluoreszierende Proteine (GFP)-Tags unterstützt41,42.

Letztendlich können diese chemisch reinen und strukturell homogenen Proteinproben für die Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), biochemische Target-Engagement-Assays, Immunisierung zur Bindergenerierung und zellfreie funktionelle Studien durch Rekonstitution in chemisch definierte Liposomen verwendet werden.

Protocol

ANMERKUNG: Alle Codon-optimierten RESOLUTE SLC-Gene wurden in AddGene43 deponiert, dessen Links auf der Liste der öffentlichen RESOLUTE-Reagenzien44 verfügbar sind. Diese Gene wurden in das pDONR221-Plasmid kloniert und ermöglichen die direkte Klonierung der Gene in den Zielvektor mittels Rekombinationsklonierung45. Um die Parallelität zu maximieren, werden Bakterien-, Insekten- und Säugetierzellen im Blockformat für die Bacmid-Produktion (Absc…

Representative Results

SLC-Gene können aus RESOLUTE pDONR-Plasmiden in BacMam-Vektoren für die Säugetierexpression kloniert werdenDie beschriebenen Protokolle für Klonierung, Expression und Aufreinigung haben sich für viele SLC-Transporter über mehrere Proteinfaltungen hinweg bewährt. Nichtsdestotrotz enthalten die Verfahren mehrere Kontrollpunkte zur Überwachung des Fortschritts, die eine Optimierung ermöglichen, um Unterschiede in der Expression, der Proteinfaltung, der lipid- und detergenzienabhängigen Stabili…

Discussion

Die Entwicklung von SLC-gerichteten Therapien wurde durch das Fehlen einer systematischen Charakterisierung der Transporterfunktion behindert. Dies hat dazu geführt, dass im Vergleich zu GPCRs und Ionenkanälen63 unverhältnismäßig weniger Medikamente auf diese Proteinklasse abzielen, obwohl sie zahlreiche Rollen in normalen und pathophysiologischen Prozessen spielen. RESOLUTE ist ein internationales Konsortium, das sich zum Ziel gesetzt hat, modernste Forschungstechniken und -werkzeuge zu entw…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde im Rahmen des RESOLUTE-Projekts durchgeführt. RESOLUTE wurde vom Gemeinsamen Unternehmen Innovative Medicines Initiative 2 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 777372 gefördert. Dieses gemeinsame Unternehmen wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union und EFPIA unterstützt. Dieser Artikel gibt nur die Ansichten der Autoren wieder, und weder das IMI noch die Europäische Union und die EFPIA sind für die Verwendung der darin enthaltenen Informationen verantwortlich. Das pHTBV-Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. Frederick Boyce (Harvard) zur Verfügung gestellt.

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
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Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
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