ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

חלבוני ממברנה הם כבר זמן רב מטרות לחוקרים ולתעשיות התרופות כאחד. מתוכם, נשאי המומסים (SLCs) הם משפחה של למעלה מ-400 גנים טרנספורטרים משניים המקודדים בתוך הגנום האנושי¹. מובילים אלה מעורבים ביבוא וייצוא של מולקולות רבות, כולל יונים², מוליכים עצביים³, שומנים 4,5,6,7, חומצות אמינו ⁸, חומרים מזינים 9,10,11, ותרופות ¹². עם רוחב כזה של מצעים, חלבונים אלה מעורבים גם במגוון של פתופיזיולוגיות באמצעות הובלת רעלים¹³, הובלה ועיכוב על ידי סמים של התעללות 14,15^, או מוטציות מזיקות¹⁶. הומולוגים חיידקיים שימשו כאבות-טיפוס למנגנון ההובלה הבסיסי של מספר משפחות SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. בניגוד לחלבונים אנושיים, אורתולוגים פרוקריוטים לרוב באים לידי ביטוי טוב יותר במערכת הביטוי Escherichia coli ^26,27 המובנת היטב והם יציבים יותר בדטרגנטים הקטנים יותר המניבים גבישים מסודרים היטב לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ²⁸. עם זאת, רצף והבדלים פונקציונליים מסבכים את השימוש בחלבונים מרוחקים אלה לגילוי תרופות^29,30. כתוצאה מכך, מחקר ישיר של החלבון האנושי נדרש לעתים קרובות כדי לפענח את מנגנון הפעולה של תרופות המכוונות SLCs 31,32,33,34,35. בעוד שההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (Cryo-EM) אפשרה אפיון מבני של SLCs בתנאים דומים יותר לילידים^36,37, קושי לבטא ולטהר חלבונים אלה נותר אתגר לפיתוח טיפולים ואבחון ממוקדים.

כדי להקל על אתגר זה, קונסורציום RESOLUTE (re-solute.eu) פיתח משאבים ופרוטוקולים לביטוי וטיהור בקנה מידה גדול של חלבונים אנושיים ממשפחת SLC³⁸. החל מגנים המותאמים לקודון, פיתחנו שיטות לשיבוט וסינון בעלי תפוקה גבוהה של מבני SLC. שיטות אלה יושמו באופן שיטתי על כל משפחת SLCs, הגנים שובטו למערכת הביטוי הנגיפי BacMam, וביטוי החלבונים נבדק בקווי תאים אנושיים³⁹ בהתבסס על שיטות שתוארו קודם לכן לשיבוט בתפוקה גבוהה ובדיקת ביטוי⁴⁰. לסיכום, הגן SLC משובט מפלסמיד pDONR221 לווקטור pHTBV1.1. מבנה זה משמש לאחר מכן לטרנספורמציה של הגן המעניין לווקטור bacmid להעברת תאי חרקים, הכולל מקדם ציטומגלווירוס ואלמנטים משפרים לביטוי בתאי יונקים. הבקולווירוס המתקבל יכול לשמש להתמרה של תאי יונקים לביטוי של חלבון SLC המטרה.

בהמשך פיתחנו שיטות סטנדרטיות לביטוי בקנה מידה גדול וטיהור יציב של SLCs נבחרים (איור 1). פרוטוקול זה כולל נקודות ביקורת מרובות כדי להקל על פתרון בעיות יעיל ולמזער את השונות בין ניסויים. יש לציין כי ניטור שגרתי של ביטוי ולוקליזציה של חלבונים, כמו גם אופטימיזציה בקנה מידה קטן של תנאי טיהור עבור מטרות בודדות, נעזרו בתגי Strep וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)^41,42.

בסופו של דבר, דגימות חלבון טהורות כימית והומוגניות מבחינה מבנית אלה יכולות לשמש לקביעה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופ אלקטרונים Cryo-Electron (Cryo-EM), בדיקות ביוכימיות של מעורבות מטרות, חיסון ליצירת קלסרים, ומחקרים פונקציונליים ללא תאים באמצעות בנייה מחדש לליפוזומים מוגדרים כימית.