التعبير عالي الإنتاجية وتنقية ناقلات المذاب البشري للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية
Summary
تتطلب الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية لناقلات الأغشية البشرية كميات ملليغرام من البروتين المستقر والسليم والمتجانس. نصف هنا الطرق القابلة للتطوير لفحص ناقلات ناقلات المذاب البشري والتعبير عنها وتنقيتها باستخدام الجينات المحسنة للكودون.
Abstract
ناقلات المذاب (SLCs) هي ناقلات غشائية تستورد وتصدر مجموعة من الركائز الداخلية والخارجية ، بما في ذلك الأيونات والمغذيات والمستقلبات والناقلات العصبية والمستحضرات الصيدلانية. على الرغم من ظهورها كأهداف علاجية جذابة وعلامات للمرض ، إلا أن هذه المجموعة من البروتينات لا تزال تعاني من نقص الأدوية نسبيا من قبل الأدوية الحالية. يتم إعاقة مشاريع اكتشاف الأدوية لهذه الناقلات بسبب المعرفة الهيكلية والوظيفية والفسيولوجية المحدودة ، ويرجع ذلك في النهاية إلى الصعوبات في التعبير عن هذه الفئة من البروتينات المضمنة في الغشاء وتنقيتها. نوضح هنا طرقا للحصول على كميات عالية النقاء وملليغرام من بروتينات ناقل SLC البشرية باستخدام تسلسلات جينية محسنة للكودون. بالاقتران مع الاستكشاف المنهجي لتصميم البناء والتعبير عالي الإنتاجية ، تضمن هذه البروتوكولات الحفاظ على السلامة الهيكلية والنشاط الكيميائي الحيوي للبروتينات المستهدفة. نسلط الضوء أيضا على الخطوات الحاسمة في تعبير الخلايا حقيقية النواة ، وتنقية التقارب ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم لهذه البروتينات. في النهاية ، ينتج عن سير العمل هذا مستحضرات بروتينية نقية ونشطة وظيفيا ومستقرة مناسبة لتحديد البنية عالية الدقة ، ودراسات النقل ، ومقايسات مشاركة الجزيئات الصغيرة ، والفحص عالي الإنتاجية في المختبر .
Introduction
لطالما كانت البروتينات الغشائية أهدافا للباحثين والصناعات الدوائية على حد سواء. من بين هؤلاء ، فإن ناقلات المذاب (SLCs) هي عائلة تضم أكثر من 400 جين ناقل ثانوي مشفر داخل الجينوم البشري1. تشارك هذه الناقلات في استيراد وتصدير العديد من الجزيئات ، بما في ذلك الأيونات2 ، والناقلات العصبية3 ، والدهون4،5،6،7 ، والأحماض الأمينية8 ، والمغذيات9،10،11 ، والمستحضرات الصيدلانية 12. مع هذا الاتساع في الركائز ، فإن هذه البروتينات متورطة أيضا في مجموعة من الفيزيولوجيا المرضية من خلال نقل السموم13 ، أو نقل وتثبيط تعاطي المخدرات 14،15 ، أو الطفرات الضارة16. كانت المتجانسات البكتيرية بمثابة نماذج أولية لآلية النقل الأساسية للعديد من عائلات SLC17،18،19،20،21،22،23،24،25. على عكس البروتينات البشرية ، غالبا ما يتم التعبير عن تقويم بدائيات النواة بشكل أفضل في نظام تعبير الإشريكية القولونية المفهوم جيدا 26,27 وتكون أكثر استقرارا في المنظفات الأصغر التي تنتج بلورات مرتبة جيدا لعلم البلورات بالأشعة السينية28. ومع ذلك ، فإن التسلسل والاختلافات الوظيفية تعقد استخدام هذه البروتينات ذات الصلة البعيدة لاكتشاف الأدوية29,30. وبالتالي ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى دراسة مباشرة للبروتين البشري لفك آلية عمل الأدوية التي تستهدف SLCs31،32،33،34،35. في حين أن التطورات الحديثة في الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (Cryo-EM) قد مكنت من التوصيف الهيكلي ل SLCs في ظروف أكثر شبها بالسكانالأصليين 36،37 ، فإن صعوبة التعبير عن هذه البروتينات وتنقيتها لا تزال تمثل تحديا لتطوير العلاجات والتشخيصات المستهدفة.
للتخفيف من هذا التحدي ، طور اتحاد RESOLUTE (re-solute.eu) موارد وبروتوكولات للتعبير على نطاق واسع وتنقية البروتينات البشريةمن عائلة SLC 38. بدءا من الجينات المحسنة للكودون ، قمنا بتطوير طرق للاستنساخ عالي الإنتاجية وفحص تركيبات SLC. تم تطبيق هذه الطرق بشكل منهجي على عائلة SLCs بأكملها ، وتم استنساخ الجينات في نظام التعبير الفيروسي BacMam ، وتم اختبار تعبير البروتين في خطوط الخلايا البشرية39 بناء على الطرق الموصوفة سابقا للاستنساخ عالي الإنتاجية واختبار التعبير40. باختصار ، يتم استنساخ جين SLC من بلازميد pDONR221 إلى ناقل pHTBV1.1. يستخدم هذا البناء لاحقا لنقل الجين محل الاهتمام إلى ناقل bacmid لنقل خلايا الحشرات ، والذي يتضمن محفزا للفيروس المضخم للخلايا وعناصر محسن للتعبير في خلايا الثدييات. يمكن استخدام الفيروس البقعي الناتج لتحويل خلايا الثدييات للتعبير عن بروتين SLC المستهدف.
كما طورنا طرقا موحدة للتعبير على نطاق واسع والتنقية المستقرة ل SLCs المختارة (الشكل 1). يتضمن هذا البروتوكول نقاط تفتيش متعددة لتسهيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل فعال وتقليل التباين بين التجارب. والجدير بالذكر أن المراقبة الروتينية لتعبير البروتين وتوطينه ، بالإضافة إلى تحسين ظروف التنقية على نطاق صغير للأهداف الفردية ، قد ساعدتها علامات Strep و Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.
في نهاية المطاف ، يمكن استخدام عينات البروتين النقية كيميائيا والمتجانسة هيكليا للتحديد الهيكلي عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني بالتبريد (Cryo-EM) ، ومقايسات المشاركة في الهدف البيوكيميائية ، والتحصين لتوليد المواد الرابطة ، والدراسات الوظيفية الخالية من الخلايا عن طريق إعادة التكوين إلى الجسيمات الشحمية المحددة كيميائيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وظل تطوير العلاجات التي تستهدف SLC معوقا بسبب عدم وجود توصيف منهجي لوظيفة الناقل. وقد أدى ذلك إلى انخفاض عدد الأدوية التي تستهدف هذه الفئة من البروتين بشكل غير متناسب بالنسبة إلى GPCRs والقنوات الأيونية63 ، على الرغم من أدوارها العديدة في العمليات الطبيعية والفيزيولوجية المرضية. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تنفيذ هذا العمل في إطار مشروع RESOLUTE. تلقت RESOLUTE تمويلا من التعهد المشترك لمبادرة الأدوية المبتكرة 2 بموجب اتفاقية المنحة رقم 777372. يتلقى هذا المشروع المشترك دعما من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي و EFPIA. تعكس هذه المقالة آراء المؤلفين فقط ولا تتحمل IMI ولا الاتحاد الأوروبي و EFPIA المسؤولية عن أي استخدام قد يتم للمعلومات الواردة فيها. تم توفير بلازميد pHTBV من قبل البروفيسور فريدريك بويس (هارفارد).
Materials
| 3C protease | Produced in-house | ||
| 50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| 96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
| 96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
| Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
| Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
| D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
| Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
| Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
| Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
| Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
| Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
| Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |
References
- Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
- Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
- Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
- Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
- Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
- Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
- Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
- Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
- Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
- Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
- Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
- Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
- Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
- Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
- Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
- Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
- Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -. N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
- Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl–dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
- Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
- Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
- Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
- Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
- Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
- Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
- Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
- Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
- Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
- Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
- Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
- Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
- Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
- Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
- Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
- Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
- Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
- Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
- Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
- . Resolute Public Reagents Available from: https://re-solute.eu/resources/reagents (2023)
- Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
- Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
- Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
- Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
- Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
- Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
- Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
- Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
- Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
- Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
- Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -. N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
- Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
- Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
- Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
- Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
- Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. 生物化学. 56 (30), 3962-3971 (2017).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
- Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
- Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -. P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).
