Subaraknoid Kanama Sonrası Beyin Dilimlerinde Vital ve Non-vital Beyin Perisitlerinin Görüntülenmesi
Summary
Ön araştırma, subaraknoid kanamanın (SAK) beyin perisit ölümüne neden olduğunu doğrulamaktadır. SAK sonrası perisit kontraktilitesinin değerlendirilmesi, canlı ve canlı olmayan beyin perisitleri arasında ayrım yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini beyin bölümlerinde aynı anda etiketlemek için bir prosedür geliştirilmiştir ve yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop kullanarak gözlemi kolaylaştırmıştır.
Abstract
Perisitler, serebral mikrosirkülasyon içinde yer alan ve kasılma ayarlamaları yoluyla serebral kan akışını aktif olarak modüle etmede çok önemli olan çok önemli duvar hücreleridir. Geleneksel olarak, kasılmaları, belirli koşullar altında morfolojik kaymalar ve yakındaki kılcal çap değişiklikleri gözlemlenerek ölçülür. Bununla birlikte, doku fiksasyonu sonrası, canlılığın değerlendirilmesi ve görüntülenen beyin perisitlerinin perisit kontraktilitesi tehlikeye girer. Benzer şekilde, genetik olarak etiketlenen beyin perisitleri, özellikle ön araştırmamızın beyin perisit ölümünü doğruladığı subaraknoid kanama (SAK) gibi nörolojik durumlarda, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapmada yetersiz kalmaktadır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir bir protokol geliştirilmiştir ve beyin bölümlerinde hem fonksiyonel hem de fonksiyonel olmayan beyin perisitlerinin aynı anda floresan etiketlenmesini sağlar. Bu etiketleme yöntemi, aynı anda beyin dilimi mikrovaskülatürünü işaretleyen yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop görselleştirmesine izin verir. Bu yenilikçi protokol, beyin perisit kontraktilitesini, kılcal damar çapı üzerindeki etkisini ve perisit yapısını değerlendirmek için bir araç sunar. Beyin perisit kontraktilitesinin SAK bağlamında araştırılması, serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkilerinin anlayışlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Introduction
İnce çıkıntıları ve çıkıntılı hücre gövdeleri ile ayırt edilen beyin perisitleri, mikrosirkülasyonuçevreler 1,2. Serebral kan akışı artışı ağırlıklı olarak kılcal damar genişlemesi tarafından yönlendirilirken, daha küçük arterler daha yavaş genişleme oranları sergiler3. Perisit kontraktilitesi, kapiller çap ve perisit morfolojisi üzerinde etki göstererek vasküler dinamiklerietkiler 4. Beyin perisitlerinin kasılması kılcal daralmaya yol açar ve patolojik senaryolarda aşırı kasılma eritrosit akışını engelleyebilir5. Locus coeruleus’tan salınan norepinefrin de dahil olmak üzere çeşitli faktörler, kılcal damarlarda beyin perisit kasılmasına neden olabilir6. Serebral kan akışında düzenleyici bir role sahip olan perisitler, hiperoksi7 sırasında bir oksijen sensörü görevi gören 20-HETE sentezi sergiler. Beyin perisitlerinin oksidatif-nitratif stresle tetiklenen kasılması kılcal damarları zararlı bir şekilde etkiler5. Beyin perisit kasılması ile ilgili hem in vivo hem de ex vivo araştırmalara rağmen8, beyin dilimleri içinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi ile ilgili sınırlı bilgi devam etmektedir.
En önemlisi, beyin perisitlerinin doku fiksasyonu sonrası görüntülemesi, canlılıklarını ve müteakip kasılma değerlendirmesini tehlikeye atar. Ayrıca, nörolojik bozukluklar gibi senaryolarda (ör., subaraknoid kanama – SAK), beyin perisitlerinin transgenik etiketlemesi, ön SAK kaynaklı beyin perisit ölümü çalışmamız9 tarafından onaylandığı gibi, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapamaz.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, canlı perisitleri etiketlemek için TO-PRO-3’ü kullandık, ölenler ise propidyum iyodür (PI) ile boyandı. Görüntüleme sırasında kesit aktivitesini korurken, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknolojileri kullandık. Bu makale, beyin perisitlerinin SAK sonrası serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkisini araştırmak için değerli bir araç olarak hizmet ederek, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görüntülemek için tekrarlanabilir bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayati beyin perisitlerini, hayati olmayan beyin perisitlerini ve beyin dilimlerindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Akut sıçan beyin dilimlerinde, işlem perisitlerin TO-PRO-311 ile ilk etiketlenmesini ve ardından IB412 ile mikrovasküler endotel hücrelerini gerektirir; daha sonra, ölen perisitlerin tanımlanması PI kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol basit, tekr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (81960226,81760223) alınan hibelerle desteklenmiştir; Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
