Application du pseudovirus Ha-CoV-2 pour la quantification rapide des variants du SRAS-CoV-2 et des anticorps neutralisants

1. Assemblage de virus et de particules virales Vecteurs : Achetez commercialement des vecteurs d’expression pour le SARS-CoV-2 M, E ou N ainsi que pour le SARS-CoV-2 S (type sauvage, Wt), Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529).NOTA : Les séquences protéiques des vecteurs d’expression sont fournies dans le fichier supplémentaire 1. Le fournisseur de ces vecteurs d’expression peut également être trouvé sous la table des matériaux. Cellules et culture cellulaire : Conserver HEK293T cellules dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 50 unités/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine.REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité à flux d’air laminaire. La transfection de la polyéthylèneimine (PEI) nécessite généralement 5 à 6 heures d’incubation. Les heures de début doivent être soigneusement réfléchies au préalable. Assemblage de virus et cotransfection basée sur l’IPE : Assembler des particules de Ha-CoV-2 par cotransfection de HEK293T cellules. Semez les cellules dans une boîte de Pétri de culture cellulaire de 10 cm (4-5 x 10,6 cellules par boîte) dans 10 mL de milieu DMEM complet la veille de la cotransfection. Pour cette étude, trois boîtes de Pétri sont utilisées pour ensemencer les cellules pour l’assemblage de Ha-CoV-2 de type sauvage, Delta et Omicron, respectivement. Incuber des boîtes de Pétri pendant une nuit dans un incubateur deCO2 à 37 °C. Vérifiez les plats le lendemain matin pour vous assurer que les cellules sont confluentes à 80 %. Retirer le milieu complet et le remplacer par 9 ml de milieu sans sérum DMEM. Pour chaque plat, préparer un mélange de cotransfection avec 2,5 μg de chacun des vecteurs d’expression des protéines structurelles du SRAS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg de pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (génome HaCoV2) et 2,5 μg du vecteur d’expression de la protéine S, soit les variants Delta ou Omicron S, et 45 μL de réactif de transfection à base d’IPE. Laisser le mélange de cotransfection former des complexes en incubant pendant 13 min (ne pas incuber plus de 30 min). Après l’incubation, ajoutez lentement le mélange de cotransfection dans chaque boîte de Pétri, goutte à goutte. Placez les plats dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant 6 h. Après 6 h, retirez le DMEM sans sérum et remplacez-le par un milieu DMEM complet. Récoltez le virus 48-60 h après la cotransfection. Récolte et entreposage des virus : Récolter les particules 48 h après la cotransfection. Détacher les cellules en les pipetant à plusieurs reprises sur la surface de la monocouche et prélever les cellules de chaque boîte, les placer dans des tubes à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. Prélever le surnageant et le faire passer à travers un filtre de 0,22 μM. Conservez le pseudovirus Ha-CoV-2 à -80 °C. 2. Essai d’infectiosité virale Cellules et culture cellulaire : Conserver les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 50 unités/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine. Ensemencement de cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : La veille du test d’infectiosité virale, ensemencer des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans une plaque de 96 puits dans 50 μL de milieu DMEM complet. Pour chaque plaque de 96 puits, ensemencer 2,5 x 104 cellules dans chaque puits, et un total de 2,5 x 106 cellules sont nécessaires pour une plaque. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant la nuit. Infection de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : Utilisez des particules variantes du Ha-CoV-2 pour infecter les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Le matin de l’infection, prélever 50 μL de DMEM de la plaque pré-ensemencée à 96 puits. Remplacer le milieu par 50 μL de Ha-CoV-2 de type sauvage, Delta ou Omicron pendant 18 h à 37 °C.REMARQUE : Le protocole peut être arrêté ici jusqu’à ce que l’infection ait atteint 18 h d’incubation et que la plaque soit prête à être analysée par dosage de la luciférase. Le succès de l’infection est déterminé par le test de la luciférase résultant du gène rapporteur de la luciférase exprimé dans les cellules infectées, donc plus le signal est produit, plus l’infection du variant Ha-CoV-2 est réussie. Dosage de la luciférase : Après 18 h d’incubation, ajouter 7,5 μL de tampon de lyse cellulaire directement dans chaque puits et mélanger par agitation orbitale pendant 2 min. Lyser les cellules dans un tampon de lyse pendant au moins 5 minutes à température ambiante. Préparez la solution de test de luciférase Firefly en mélangeant la solution de D-luciférine avec la solution de test de luciférase Firefly dans un rapport de 1 :50. Pour une plaque entière à 96 puits, combiner 3 mL de solution de substrat de luciférase avec 60 μL de solution de D-luciférine avec 2940 μL de solution tampon de luciférase Firefly. Ajouter 25 μL de la solution de test de luciférase Firefly aux lysats cellulaires et mélanger la plaque en agitant orbitalement pendant 1 min. Analysez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques de luciférase commercial. 3. Extraction de l’ARN de Ha-CoV-2 et PCR quantitative par transcriptase inverse (RT-qPCR) Extraction de l’ARN viral : Extraire l’ARN viral des particules de type sauvage Ha-CoV-2 et des variants Delta et Omicron du Ha-CoV-2 à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN viral commercial, en suivant les instructions du fabricant. Conservez l’ARN viral extrait à -80 °C ou utilisez-le immédiatement pour la RT-qPCR. RT-qPCR : Effectuez une RT-qPCR sur l’ARN viral à l’aide d’un master mix en une étape. Effectuez la réaction dans un appareil PCR commercial. Veuillez noter que la cible de l’amplification est l’ARN génomique de Ha-CoV-2. Utilisez l’ADN du vecteur Ha-CoV-2 comme norme pour créer une courbe standard et calculer le nombre de copies d’ARN de chaque variant. 4. Test d’anticorps neutralisants Ensemencement de cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : La veille de l’essai, ensemencer des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans une plaque de 96 puits dans 50 μL de milieu DMEM complet. HEK293T(ACE2/TMPRSS2) sont achetés dans le commerce. Pour le comptage des cellules, obtenir 20 μL de cellules d’une fiole T75 contenant des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) et mélanger avec 20 μL de solution de bleu trypan. Ajouter 20 μL de ce mélange dans la chambre de comptage des cellules et compter le nombre de cellules par ml. Pour ensemencer une plaque de 96 puits pour l’infection, utilisez 2,5 x 104 cellules par puits, et 2,5 x 106 cellules seront nécessaires au total. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant la nuit. Test d’anticorps neutralisants : Dans une plaque stérile en polypropylène à 96 puits, préparer le mélange standard d’anticorps neutralisants 27BV et de Ha-CoV-2. Ajouter 8 μL de 27BV (45 mg/mL) dans la plaque et effectuer des dilutions en série de l’anticorps avec 6 μL de DMEM sans sérum.REMARQUE : Assurez-vous d’échanger les pointes de pipette entre les transferts de puits et assurez-vous que l’anticorps et le milieu sans sérum sont bien mélangés pour produire des résultats précis. À l’anticorps dilué en série, ajoutez 54 μL de particules Ha-CoV-2 et mélangez le virus et l’anticorps. Pré-incuber des particules de Ha-CoV-2 avec du 27BV dilué en série pendant 1 h à 37 °C à 5 % de CO2. Après 1 h d’incubation, appliquer 50 μL du mélange d’anticorps et de Ha-CoV-2 sur la plaque de 96 puits contenant les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 104 cellules par puits) ensemencées la veille. Pour les témoins, laissez au moins trois puits contenant uniquement les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Ajouter 50 μL de milieu complet à ces puits pour servir de puits non infectés pour le signal de fond des lectures de l’essai de luciférase.NOTE : Le protocole peut être arrêté ici jusqu’à ce que l’infection ait atteint 18 h d’incubation à 37 °C, puis la plaque est prête à être analysée par dosage de luciférase. Dosage de la luciférase : Après 18 h d’incubation, ajouter 7,5 μL de tampon de lyse directement dans chaque puits et mélanger en agitant orbitalement pendant 2 min. Lyser les cellules dans un tampon de lyse pendant au moins 5 minutes à température ambiante. Préparez la solution de test de luciférase Firefly en mélangeant la solution de D-luciférine avec la solution de test de luciférase Firefly dans un rapport de 1 :50. Pour une plaque entière de 96 puits, combiner 3 mL de la solution de substrat de luciférase avec 60 μL de solution de D-luciférine avec 2940 μL de solution tampon de luciférase de luciférase. Ajouter 25 μL de la solution de test de luciférase Firefly aux lysats cellulaires et mélanger la plaque en agitant orbitalement pendant 1 min. Analysez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques de luciférase commercial. 5. Quantification et analyse statistique Collecte des données : Effectuer des tests d’infection et de luciférase en trois exemplaires comme indiqué (Figure 1). Quantifiez l’expression de la luciférase avec les lectures du test de luciférase. La moyenne est la valeur moyenne des trois lectures du test de luciférase. Les lectures du signal de fond des puits non infectés sont soustraites de cette valeur moyenne. L’écart-type (ET) est déterminé à partir de la valeur moyenne des lectures du test de luciférase. Analyse des données : Tracez l’activité de neutralisation des anticorps et calculez les valeurs ID50 (dose d’inhibition de 50 %) à l’aide d’un logiciel graphique commercial. La valeur ID50 est définie comme les dilutions inhibitrices d’anticorps auxquelles une réduction de 50 % de l’infection des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (sur la base des lectures du test de luciférase) est atteinte.