A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

Helena Maria D. Danielsen; Mohammad Reza Arastoo; Guillermo Moreno-Pescador; Poul Martin Bendix

doi:10.3791/65776

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生物学

Un enfoque termoplasmónico para investigar la reparación de la membrana plasmática en células vivas y membranas modelo

Published: January 19, 2024

doi:

10.3791/65776

Helena Maria D. Danielsen¹, Mohammad Reza Arastoo¹, Guillermo Moreno-Pescador^1,2, Poul Martin Bendix¹

¹The Niels Bohr Institute,University of Copenhagen, ²Department of Plant and Environmental Sciences,University of Copenhagen

Summary

El método de punción termoplasmónica integra microscopía confocal, pinzas ópticas y nanopartículas de oro para estudiar las respuestas de las proteínas durante la reparación de la membrana plasmática en células y vesículas unilamelares gigantes. La técnica permite la punción rápida y localizada de la membrana, lo que permite la identificación de proteínas clave y sus funciones en la intrincada maquinaria de reparación de la membrana plasmática.

Abstract

La membrana celular es crucial para la supervivencia celular, y garantizar su integridad es esencial, ya que la célula experimenta lesiones a lo largo de todo su ciclo de vida. Para evitar daños en la membrana, las células han desarrollado mecanismos eficientes de reparación de la membrana plasmática. Estos mecanismos de reparación pueden estudiarse mediante la combinación de microscopía confocal y termoplasmónica a nanoescala para identificar e investigar el papel de proteínas clave, como las anexinas, implicadas en la reparación de la superficie en células vivas y sistemas modelo de membrana.

El método de punción emplea un láser para inducir un calentamiento altamente localizado tras la irradiación de nanopartículas. El uso de luz infrarroja cercana minimiza la fototoxicidad en la muestra biológica, mientras que la mayor parte de la absorción tiene lugar en la nanopartícula plasmónica resonante en el infrarrojo cercano. Este método termoplasmónico se ha utilizado para posibles investigaciones fototérmicas y biofísicas con el fin de mejorar la comprensión de los mecanismos intracelulares y las respuestas celulares a través de estudios de fusión celular y de vesículas. El enfoque ha demostrado ser complementario a los métodos existentes para la disrupción de la membrana, como las lesiones inducidas mecánica, química u ópticamente, y proporciona un alto nivel de control al infligir lesiones extremadamente localizadas. El alcance de la lesión se limita a la proximidad de la nanopartícula esférica, y no se produce ningún daño perjudicial a lo largo de la trayectoria del haz a diferencia de los láseres pulsados que utilizan diferentes longitudes de onda. A pesar de ciertas limitaciones, como la formación de nanoburbujas, el método termoplasmónico ofrece una herramienta única para investigar las respuestas celulares en la reparación de la membrana plasmática en un entorno casi nativo sin comprometer la viabilidad celular.

Cuando se integra con la microscopía confocal, el método de punción puede proporcionar una comprensión mecanicista de la dinámica de la membrana en sistemas de membrana modelo, así como información cuantitativa sobre las respuestas de las proteínas al daño de la membrana, incluido el reclutamiento de proteínas y su función biofísica. En general, la aplicación de este método a sistemas modelo reducidos puede mejorar nuestra comprensión de la intrincada maquinaria de reparación de la membrana plasmática en las células vivas.

Introduction

La membrana celular, que sirve como barrera física y plataforma de señalización, es vital^{para la supervivencia} celular. A lo largo de todo su ciclo celular, la membrana plasmática (PM) está sometida a daños, como lesiones mecánicas ^2,3,4,5 y químicas⁶ inducidas por estrés. Para mantener la integridad de la membrana y garantizar la supervivencia celular, la célula ha desarrollado mecanismos robustos de reparación de la membrana plasmática (PMR). Estos mecanismos dependen de diversas estrategias, como la reorganización del citoesqueleto, la fusión de membranas y las estrategias de reemplazo de membranas 7,8,9,10,11, todas ellas basadas en el reclutamiento de proteínas específicas. En particular, los miembros de la familia de proteínas de la anexina han sido identificados como proteínas clave asociadas con los procesos de PMR 1,9,12,13,14,15,16. Después de la lesión por PM, la célula experimenta una afluencia de iones de calcio (Ca²⁺), lo que representa una amenaza inmediata para la supervivencia de la célula¹⁷. En respuesta a la afluencia de Ca²⁺, las proteínas de anexina, que se encuentran predominantemente en el citosol, se unen a la valva interna de la membrana plasmática dañada como parte de las estrategias de PMR¹⁸. La anexina A2 (ANXA2) fue uno de los primeros miembros de la familia de las anexinas en asociarse con PMR en la distrofia muscular deficiente en disferlina y se sugirió que mediaba la reparación mediante la fusión de vesículas intracelulares a la PM cerca del sitio de la lesión 5,19,20,21. Posteriormente, se han atribuido varias funciones a las anexinas²², y su papel en la PMR ha atraído una mayor atención en los últimos 20 años. Sin embargo, el papel exacto de las anexinas en la PMR aún no se comprende completamente 15,18,21,22.

Este artículo propone un método para investigar la interacción proteína-membrana y la dinámica de la membrana de una manera controlada y altamente localizada, utilizando una combinación de microscopía confocal, pinzas ópticas y nanopartículas de oro (AuNPs). Este método permite el estudio cuantitativo de las interacciones entre proteínas, lípidos y moléculas pequeñas en respuesta al daño de la membrana y la afluencia de Ca²⁺ . A pesar de la complejidad y multiplicidad de componentes involucrados en el proceso de reparación de la membrana, se han empleado sistemas de membrana simplificados que imitan la membrana plasmática para obtener una comprensión mecanicista más profunda de la dinámica de la membrana y la respuesta de las proteínas de anexina a la disrupción de la membrana¹⁶. Se eligieron vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUV) como sistema modelo de membranas con una composición lipídica especificada. Los GUV se generaron utilizando el método de hidratación asistida por gel, específicamente la hidratación en gel de alcohol polivinílico, según lo descrito por Weinberger et ^al.23, lo que permitió la encapsulación eficiente de las anexinas en los GUV.

La utilización de la irradiación láser de infrarrojo cercano (NIR) sobre nanopartículas metálicas (NP) induce un calentamiento significativo de la NP, lo que la convierte en un método eficaz para establecer una fuente de calor local explotada en aplicaciones biomédicas²⁴. El método se utilizó inicialmente para medir directamente la temperatura que rodea a un solo AuNP en ensayos biomiméticos 2D y 3D. En estos ensayos^25,26, las nanopartículas plasmónicas se irradiaron sobre una bicapa lipídica soportada o se atraparon ópticamente cerca de los GUV que experimentan una transición de fase térmica local tras el calentamiento local, lo que permite cuantificar y controlar el perfil de temperatura exacto alrededor de la partícula. Este perfil de temperatura de referencia se ha utilizado cuando se investigan o manipulan muestras biológicas. Nuevos avances en el método han facilitado la inducción de poros nanoscópicos en las membranas²⁷, lo que permite la fusión de vesículas y células^28,29. Otros estudios han investigado el comportamiento de las proteínas de membrana periférica en GUVs²⁹ y proteínas transmembrana³⁰ mediante la creación de nuevas vesículas híbridas, mientras que la administración de fármacos específicos de células también se ha explorado para controlar y estudiar las respuestas celulares o la expresión génica 28,29,31,32,33. Recientemente, el método se ha utilizado para investigar las respuestas de las proteínas al daño de la membrana 32,34,35.

Existen varios métodos para interrumpir la membrana plasmática con el fin de explorar las respuestas celulares y la reparación de la membrana. Estos incluyen punciones con microagujas, agitación de microperlas y raspado celular, todos los cuales pueden alterar mecánicamente la membrana celular 14,36,37. El daño inducido químicamente se puede lograr mediante la adición de detergentes ^5,38 o toxinas bacterianas^39,40 que desestabilizan la bicapa lipídica y generan poros de membrana a través de la membrana plasmática. Además, las lesiones inducidas ópticamente por láseres de onda continua y pulsados se han utilizado para estudiar los componentes de PMR, como las proteínas^de anexina 5,14,21,41, en combinación con nanopartículas plasmónicas 42,43,44,45. A pesar de la eficiencia de los láseres pulsados de alta potencia, pueden causar lesiones y daños significativos en el interior de la célula a lo largo de la trayectoria del haz. Además, los cambios detallados que se producen en la materia biológica tras la irradiación láser pulsada y si crea un poro bien definido aún no se han investigado. En este artículo se presenta un método alternativo que emplea termoplasmónica para inducir agujeros nanoscópicos en el PM de forma controlada^34,35 sin causar daños significativos a las estructuras internas. Esto se logra mediante la exposición de NPs plasmónicas a un láser NIR altamente enfocado, lo que resulta en un aumento de temperatura extremadamente localizado que puede alcanzar fácilmente temperaturas superiores a 200 °C, lo que puede conducir a pequeñas explosiones nanoscópicas 25,46,47. Este proceso se puede controlar ajustando la intensidad del láser, así como el tamaño, la forma y la composición de los NP⁴⁸. Al emplear esta técnica, los investigadores pueden explorar el papel de las proteínas en la reparación de PM en células vivas, lo que podría ayudar a abordar algunas de las preguntas sin respuesta sobre la participación de las proteínas de anexina en la reparación de la membrana sin comprometer la viabilidad celular.

El atrapamiento óptico de nanopartículas plasmónicas ha sido bien establecido por estudios previos 25,49,50,51,52; sin embargo, se pueden obtener conocimientos adicionales sobre las propiedades termoplasmónicas de las nanopartículas 53,54,55 en los materiales suplementarios (Archivo Suplementario 1). El método termoplasmónico se puede utilizar para crear agujeros nanoscópicos en el PM con el fin de estudiar la respuesta celular y los mecanismos de reparación. Más precisamente, la punción se puede lograr mediante el calentamiento óptico de AuNPs en las proximidades de la membrana, como se muestra en las Figuras 1A y B. Esta punción localizada permite la entrada de Ca²⁺, que fue verificada por un sensor de calcio, activando así la maquinaria PMR. Para los experimentos con células vivas, se inmovilizaron AuNPs con un diámetro de 200 nm en la superficie debajo de la célula para monitorizar el papel de ANXA2 en PMR a través de microscopía confocal. El láser NIR (Figura 1A, B), con una longitud de onda de 1064 nm, irradia el AuNP, explotando sus propiedades plasmónicas (Figura 1C), lo que resulta en un calentamiento local sustancial (Figura 1D) en la ventana de transparencia biológica⁴⁹ mientras causa un daño mínimo a la propia célula. La región de alta temperatura que rodea el AuNP disminuye rápidamente en un 30-40% a una distancia correspondiente al radio del NP, como se muestra en la Figura 1E, lo que permite una lesión extremadamente confinada en las tres dimensiones.

Expediente Complementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 1: Esquema esquemático del método experimental. (A) las células transfectadas con ANXA están situadas encima de nanopartículas de oro inmovilizadas (AuNPs) en la superficie, o (B) vesículas unilamelares gigantes (GUVs) con ANXAs encapsuladas están suspendidas en un medio que contiene AuNPs. (C) Un solo AuNP es irradiado por la trampa óptica NIR, donde la interacción entre el campo electromagnético entrante y los electrones de conducción conduce a la oscilación colectiva de electrones dentro del NP. (D) Este proceso da como resultado un aumento de temperatura altamente confinado pero significativo. Para estimar la temperatura en la superficie del NP, se emplea la teoría de Mie, y se calcula un perfil de temperatura (E) para un AuNP con un diámetro de 200 nm y una intensidad láser I = 6,36 x 10⁸ W/cm². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para minimizar el efecto térmico sobre la membrana celular, las AuNP solo se irradian durante ~ 1 segundo. Esto provoca un estallido transitorio y local de calentamiento, lo que reduce el daño a las proteínas que normalmente requieren más tiempo para desplegarse. Tras la punción de la membrana, las proteínas de anexina se reclutan en una fracción de segundo y, en pocos segundos, se forma un andamio en forma de anillo de anexina alrededor del sitio de la lesión (Figura 2). Este enfoque también se ha aplicado para explorar la participación de ANXA5 tanto en células vivas como en membranas modelo¹⁶ en un esfuerzo por arrojar luz sobre el esquema completo de los procesos de reparación. Si bien el enfoque principal se ha centrado en el reclutamiento correlacionado de varias proteínas de anexina, los aspectos biofísicos del mecanismo de reparación aún no se han dilucidado.

Para implementar completamente el método propuesto, se requieren tres componentes clave: microscopía confocal, pinzas ópticas y nanopartículas metálicas. Las pinzas ópticas se utilizan para atrapar AuNPs, y su construcción se puede lograr siguiendo el procedimiento descrito por Neuman et ^al.49. Sin embargo, si la construcción de una pinza óptica resulta ser demasiado difícil, se puede utilizar un láser NIR bien enfocado para irradiar AuNPs inmovilizadas debajo de las células. Si bien se eligieron AuNP esféricas para este protocolo, también se pudo utilizar una variedad de partículas plasmónicas con espectros de absorción sintonizables para lograr un gradiente de temperatura altamente localizado dentro de la región NIR⁴⁸.

La obtención de imágenes de fluorescencia es necesaria para observar el papel de las proteínas marcadas con fluorescencia y, por lo tanto, la microscopía de reflexión interna total (TIRF)⁵⁶ podría considerarse como una alternativa a la obtención de imágenes confocal. Sin embargo, esta técnica solo permite obtener imágenes de superficie y no sería compatible con los experimentos de vesículas de membrana modelo. En consecuencia, tanto las pinzas ópticas como el microscopio confocal son esenciales para la localización precisa de la nanopartícula y la investigación detallada del área local que rodea la lesión celular. Para irradiar eficazmente la nanopartícula con un foco láser limitado por difracción, es necesario visualizar la nanopartícula. Esto se puede lograr de manera óptima mediante microscopía de reflexión, que es una característica de imagen estándar de los microscopios confocales Leica. Sin embargo, si no se dispone de imágenes de reflexión o dispersión, se pueden considerar métodos alternativos, como el marcaje fluorescente de AuNP menos eficiente.

En resumen, el método termoplasmónico altamente controlable y localizado presentado en este estudio tiene el potencial de servir como una excelente plataforma para investigar los componentes moleculares involucrados en las respuestas celulares y los mecanismos de reparación de PM en células vivas. Además de estudiar la respuesta de la proteína al daño por PM, este enfoque también se puede utilizar para perforar localmente vesículas, lo que permite una investigación de la respuesta de la proteína tanto en la dinámica proteína-proteína como en la proteína-membrana. Además, este método permite un análisis cuantitativo de las interacciones entre proteínas, lípidos y moléculas pequeñas cuando se rompen las membranas. En conjunto, estos avances tienen el potencial de arrojar luz sobre algunas de las preguntas no resueltas relacionadas con la intrincada y compleja maquinaria de reparación de membranas plasmáticas.

Protocol

1. Preparación para la punción de la membrana celular Siembra celular (Día 1)Cultivar células embrionarias humanas de riñón (HEK293T) en medio de cultivo a 37 °C en una incubadora humidificadora deCO2 al 5% hasta que alcancen el 70% de confluencia. Separe las células de la superficie utilizando 500 μL de tripsina, cuente 200.000 células HEK293T y siembre en una placa de cultivo con un volumen total de 3 mL de medio de cultivo. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificadora deCO2 al 5% durante 24 h.NOTA: Para evitar la agrupación de células en el centro de la placa, extienda las células de manera uniforme y evite agitar la placa, ya que esto puede disminuir la eficiencia de la transfección. Transfección celular (Día 2)NOTA: Las células transfectadas se pueden utilizar hasta 48 h después de la transfección.Pipetear el plásmido de interés y el reactivo de transfección durante 5 s antes de su uso. En un tubo estéril de 2 ml, mezcle lo siguiente en el orden específico: 500 μl de medio sérico reducido, 5 μl de reactivo de transfección (4 veces más que el plásmido) y 1,25 μl de plásmido (1 μg/μl).NOTA: Para investigar la entrada de calcio tras la ruptura de la membrana, siga el mismo procedimiento, pero utilice la sonda del sensor de calcio unido a la membrana GCaMP6-CAAX (1 μg/μL). Pipetear suave pero minuciosamente la mezcla de transfección e incubarla a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos antes de añadirla gota a gota a las células. Antes de añadir la mezcla de transfección, retire el medio de la placa de cultivo, lave suavemente las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato y añada 2000 μl de medio sérico reducido a la placa. Incubar las células junto con la mezcla de transfección a 37 °C en una incubadora humidificadora de CO2 al 5% durante 2 h y 45 min antes de cambiar el medio a 3 mL de medio de cultivo. Preparación de la solución de nanopartículas de oro (AuNP) (Día 2)Agitar la solución madre de AuNP de 200 nm durante 10 s en el nivel 10 (ver Tabla de materiales para obtener más especificaciones del aparato), sonicar durante 5 min (amplitud máxima) y vórtice de nuevo durante 10 s. Mezclar 150 μL de AuNPs con 850 μL de agua destilada hasta obtener un volumen total de 1 mL.NOTA: La solución diluida de AuNP puede almacenarse en la nevera y reutilizarse hasta por 1 mes. Preparación del plato experimental (Día 2)Cubra la placa de micropocillos con 150 μL de solución de unión celular al 0,01%-0,1% e incube durante 15 min a RT. Lave la superficie del vidrio dos veces con 500 μL de agua destilada y déjela secar al aire durante ~10 min. Añadir 80 μL de solución de AuNP gota a gota sobre la superficie seca.NOTA: Vórtice (10 s), sonique (5 min) y vórtice (10 s) la solución de AuNP diluida antes de agregarla a la superficie de vidrio recubierta para minimizar los agregados de AuNP. Espere ~10 min antes de introducir 1,5 mL de medio de cultivo. Deje que el plato se incube a 37 °C durante la noche. Preparación de la cámara experimental (Día 3)NOTA: La cámara experimental se puede preparar en el día 3 o 4; Sin embargo, asegúrese de que los siguientes preparativos se realicen el mismo día del experimento.Retire el medio de las células en la placa de cultivo y lave las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato.NOTA: Este paso es esencial para eliminar cualquier medio residual y escombros que puedan interferir con los pasos posteriores. Agregue 500 μL de solución de desprendimiento celular a base de enzimas al pocillo e incube durante 1-3 minutos hasta que las células se hayan desprendido de la placa de cultivo. Agregue 1,5 ml de medio de cultivo fresco y pipetee la solución celular para obtener una solución celular homogénea para minimizar la probabilidad de grupos celulares. Retire con cuidado el medio de las AuNP en el micropocillo experimental. Añadir la solución celular (2 mL) al micropocillo y dejar incubar durante al menos 5 h antes de realizar el experimento.NOTA: Para condiciones experimentales óptimas, evite agitar la cámara, ya que esto puede hacer que las células se agrupen en el centro de la cámara. 2. Experimento de punción de membrana celular Ajustes ópticos del experimentoRealice los experimentos utilizando un microscopio de barrido confocal combinado con un láser de captura de 1064 nm57. Lleve a cabo el reventado óptico en el plano focal utilizando un objetivo de inmersión en agua de 63x con una apertura numérica (NA) de 1,2. Supongamos que el foco es del tamaño de un disco de Airy y que el ancho del haz focal del láser de irradiación es de ~540 nm de radio. Convierta la potencia del láser (P) en la intensidad del láser correspondiente (I) calculando la potencia del láser por área (W/cm2). Utilice un divisor de haz óptico acústico (AOBS) para visualizar múltiples señales fluorescentes detectadas mediante tubos fotomultiplicadores y la detección simultánea de NP metálicos a través de su señal de dispersión.NOTA: No todos los sistemas confocales están equipados con AOBS, lo que permite la obtención de imágenes por reflexión de NP metálicos. En este caso, se deben implementar otras formas de detección, o se puede intentar un escaneo secuencial del láser NIR en el área debajo de la célula. Durante las sesiones experimentales, monte en el microscopio una cámara abierta con fondo de vidrio que contenga células, sondas moleculares fluorescentes y nanopartículas de oro. Mueva la trampa en relación con las células trasladando la muestra montada en una platina piezoeléctrica, lo que permite movimientos laterales con precisión nanométrica16.NOTA: La trampa óptica se mantiene estacionaria. Ajustes experimentales para la punción de la membrana celularColocar HEK293T células, transfectadas con plásmidos de anexina acoplados con una proteína fluorescente, encima de AuNPs aisladas que están inmovilizadas en la superficie del vidrio (Figura 1A). Utilice un láser de argón de 488 nm para visualizar la señal de fluorescencia de GFP y un láser HeNe de 633 nm para observar la reflexión de AuNP en el microscopio confocal de barrido. Emplee la pinza óptica, que funciona con un láser NIR de 1064 nm, para irradiar un solo AuNP durante ~ 1 s, induciendo un aumento local significativo de la temperatura que altera la membrana plasmática. Aplique irradiación entre 200-295 mW a la partícula enfocada, lo que resulta en un aumento sustancial de la temperatura.NOTA: Hay una pérdida sustancial de potencia dentro de la óptica, con la potencia del láser en el punto focal alcanzando alrededor del 20% del milivatio indicado, dependiendo de la configuración específica. La intensidad específica (medida en W/cm2) depende de la alineación exacta del sistema, específicamente del tamaño focal. Además, la conducción de calor del vidrio es mayor que la de la célula y el agua y, en consecuencia, la reducción de la cantidad de calor liberada a la membrana plasmática se reduce ligeramente48,58. Logre una lesión por PM efectiva y localizada y la posterior respuesta de reparación de proteínas calibrando adecuadamente la localización del punto de enfoque del láser NIR. Esto se logra capturando un solo AuNP suspendido en el mismo medio de imagen y asegurándose de que el AuNP seleccionado esté enfocado antes de la irradiación.NOTA: Se considera que la nanopartícula está enfocada cuando su señal de dispersión aparece más nítida, es decir, exhibiendo bordes claros y la ausencia de un halo alrededor de la partícula, cuando se observa en microscopía confocal (Figura 2C (ii)). Condiciones de densidad de células y AuNPElija células individuales en lugar de grupos celulares para evitar la superposición de las membranas plasmáticas.NOTA: Las células deben estar adheridas a la superficie, exhibiendo una morfología aplanada (Figura suplementaria 1), lo que permite perforar la periferia celular al tiempo que evita daños en la membrana nuclear (Figura suplementaria 2). Incubar las células de acuerdo con el protocolo o hasta que se hayan asentado y aplanado para evitar la absorción celular de AuNP. Evite el tiempo excesivo de incubación y reduzca la probabilidad de endocitosis de AuNP utilizando AuNPs pegiladas. Asegúrese de que las AuNP inmovilizadas estén presentes como partículas individuales, adecuadamente separadas entre sí para evitar agregados. Los agregados pueden conducir a un aumento significativo en el gradiente térmico, lo que resulta en temperaturas elevadas que pueden alterar una fracción sustancial de la celda. Reemplace la muestra cada 1-2 h para mantener la salud celular.NOTA: La exposición prolongada puede provocar un deterioro de la salud celular, comprometiendo su capacidad para responder con precisión a las lesiones en términos de reparación de la membrana. Esta disminución en la salud celular se observa típicamente por un cambio en la forma celular, ya que las células parecen más esféricas y más rígidas, lo que finalmente culmina en la muerte celular. Información complementaria. Haga clic aquí para descargar este archivo. 3. Preparación de vesículas unilamelares gigantes (GUV) Preparación de la mezcla lipídicaRealice la composición lipídica del GUV combinando los lípidos 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (DOPS) en una proporción molar de 4:1 (ver Tabla 1). Alicuar el stock lipídico en viales de vidrio de 1,5 ml según las necesidades experimentales y almacenarlos a -20 °C.NOTA: Para una conservación prolongada de los lípidos y para evitar la oxidación de los lípidos insaturados, sustituya el aire por argón en los viales alícutos. Antes de mezclar los lípidos, limpie a fondo una jeringa de vidrio o metal de 50 μL y otra de 500 μL con cloroformo cinco veces para asegurarse de que estén libres de contaminantes para los lípidos disueltos en cloroformo.PRECAUCIÓN: Manipule el cloroformo en una campana extractora debido a su toxicidad.Transfiera el volumen calculado de cloroformo a un vial limpio de vidrio ámbar, seguido de la cantidad especificada de cada lípido (ver Tabla 1).NOTA: Para evitar la contaminación cruzada entre las existencias de lípidos, asegúrese de que las jeringas se limpien con cloroformo. Finalmente, agregue el tinte de membrana y mezcle bien los lípidos mediante pipeteo. Almacenar la mezcla lipídica preparada a -20 °C para su uso posterior; La mezcla permanece viable durante 2-3 semanas sin ningún daño lipídico considerable.NOTA: La mezcla debe hacerse con una jeringa metálica o de vidrio. Mantenga siempre los lípidos en hielo cuando estén fuera del congelador. Preparación de gel de alcohol polivinílico (PVA)Preparar los GUV utilizando el método de hidratación asistida por gel descrito por Weinberger et al.23con pequeñas modificaciones.Prepare el gel de PVA disolviendo 5 g de PVA en 100 ml de un tampón que contenga 50 mM de sacarosa, 25 mM de NaCl y 25 mM de Tris (pH 7,4). Calentar la solución de PVA a 85 °C y agitar hasta que se vuelva transparente. Deje que se enfríe a RT y guárdelo en un refrigerador para su uso posterior.NOTA: El PVA no se disuelve correctamente en el tampón y, por lo tanto, es necesario calentarlo hasta 85 °C. Preparación de portaobjetos de vidrioLimpie los portaobjetos de vidrio con etanol y déjelos secar al aire. Luego, trate los portaobjetos con un limpiador de plasma de aire para eliminar cualquier contaminación residual de la superficie del vidrio. Preparación de portaobjetos de vidrio recubiertos de PVACalentar el gel de PVA (5%) hasta 60 °C durante 30 min para aumentar su fluidez. Aplique 90 μL de PVA tibio en el portaobjetos de vidrio, extiéndalo uniformemente y déjelo secar en una cámara calefactora a 50 °C durante 50 min. Una vez que el portaobjetos de vidrio PVA esté listo, agregue 30 μL de la mezcla lipídica preparada con una jeringa de vidrio o metal y extiéndalo en una película delgada usando el borde de la aguja. Seque la mezcla lipídica evaporando su contenido de cloroformo bajo una suave presión de nitrógeno. Además, seque los portaobjetos de vidrio al vacío durante 1,5-2 h. Cultivo de GUV en una cámaraEnsamble la cámara interna, con un diseño similar al de un informe publicado anteriormente59, utilizando el portaobjetos de vidrio preparado. En un tubo separado de 2 ml, diluir la proteína recombinante de interés (en este caso, ANXA5 o ANXA4) hasta una concentración final de 500 nM con un tampón de crecimiento (GB) que consta de 80 mM de sacarosa, 70 mM de NaCl y 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4). Añadir 400 μL de la solución de proteína recombinante diluida a la cámara. Incubar la cámara en RT durante 1 h para permitir que los GUV crezcan a partir de la capa lipídica depositada. Utilice el mismo tampón, excluyendo la proteína, como control negativo.NOTA: Envuelva la cámara en una película de poliolefina para evitar la evaporación del tampón. Recoja los GUV transfiriendo 400 μL del contenido de la cámara a un tubo de 2 mL. Elimine las proteínas no encapsuladas fuera de los GUV agregando 1 mL de tampón de observación (OB) que contenga 55 mM de glucosa, 70 mM de NaCl y 50 mM de Tris-HCl (pH 7.4) a la solución recolectada. A continuación, centrifugar la solución a 600 x g durante 10 min a 13 °C. Después de la centrifugación, reemplace 1 ml del sobrenadante con un volumen igual de tampón de observación. Disperse los GUV mediante un pipeteo suave y guárdelos en el refrigerador hasta que se utilicen en experimentos de GUV. 4. Experimento de punción GUV Preparación de la cámaraUtiliza un plato con fondo de cristal de 35 mm para el experimento. Para evitar que los GUV se adhieran a la superficie y revienten, cubra la superficie con β-caseína (5 mg/ml) durante 15-30 min.Para la solución de β-caseína, disolver 0,1 g de la proteína en un tampón de 20 ml de 20 mM de Tris (PH 7,5) y 100 mM de NaCl. Filtre la solución proteica, colóquela en viales pequeños y congélela para su uso posterior. Lave la cámara dos veces con tampón de observación para eliminar el exceso de β-caseínas libres de la superficie y déjela secar a RT. En un tubo separado de 2 ml, mezcle los GUV recolectados con OB. Agregue CaCl2 a la mezcla para obtener la concentración final deseada (en este caso, 200 μM). Introduzca nanocapas de oro (AuNS) de 150 nm a la mezcla en una proporción de 1:100. La mezcla final comprende 250 μL de GUVs, 225 μL de OB, 20 μL de CaCl2 (5 mM) y 5 μL de los AuNSs especificados. Configuración experimentalTransfiera la mezcla a la cámara y móntela en la platina del microscopio. Dependiendo del tamaño de la cámara, agregue toda la mezcla o una parte de la mezcla.NOTA: El tiempo es crítico ya que los iones de calcio pueden pasar a través de la membrana y mediar la unión de las anexinas a la valva interna de la membrana. Emplee la misma configuración óptica utilizada para los experimentos de perforación de células. Utilice las pinzas ópticas para atrapar un AuNS individual muy cerca o en la superficie de un GUV aplicando una potencia láser de ~ 125 mW. Posteriormente, aumente la potencia del láser a ~ 300 mW. Esto produce un aumento de temperatura muy localizado, que rompe y perfora la membrana en el sitio objetivo.NOTA: Los AuNS son los preferidos para los experimentos GUV debido a su capacidad para generar un mayor aumento transitorio de la temperatura mientras mantienen un tamaño más pequeño en comparación con los AuNP sólidos. Tabla 1: Tabla para determinar la composición del GUV. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 5. Mediciones y análisis de datos de la respuesta de ANXA en experimentos de punción celular Utilice MATLAB para analizar las imágenes y calcular y representar el perfil de temperatura de AuNP (Figura 1D, E) basado en las ecuaciones60,61 de Mie. Además, procese todas las imágenes confocales utilizando la distribución FIJI ImageJ 62,63. Cálculo del radio del anillo ANXARecorte la región de interés que contiene el área perforada a partir de los datos sin procesar antes del análisis de lesiones en la membrana. Emplee el flujo de trabajo interno de MATLAB para procesar cada imagen marcando manualmente el centro del anillo ANXA y su perímetro exterior.Utilice estas marcas para establecer los límites de procesamiento de la región de interés.NOTA: El área se procesa radialmente dentro de los límites establecidos, y la intensidad de fluorescencia a una distancia específica al centro es el promedio sobre el círculo completo con la misma distancia al centro. Este número se almacena para cada paso de radio. Utilice el flujo de trabajo para ajustar las intensidades promediadas en todo el rango de escaneo a una curva gaussiana unidimensional para identificar los máximos (Rp) y el ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) correspondientes a Rext y Rint, respectivamente, como se muestra en la Figura 3A. Por último, determine el radio del anillo ANXA por la distancia desde el centro del anillo hasta Rext dada por la gráfica generada por el flujo de trabajo de MATLAB. Cálculo tridimensional del radio del anillo ANXARealice un seguimiento del cambio en el radio del anillo ANXA en la dirección z utilizando el mismo flujo de trabajo de análisis de MATLAB que en el paso 5.1. Aplique el flujo de trabajo a varias secciones en Z confocales a lo largo de la herida de la membrana, como se ilustra en la Figura 3C, E. Calcule la pendiente de cada herida en función del cambio en los radios de las secciones z, como se muestra en la Figura 3F. Evolución temporal del radio del anillo ANXADel mismo modo, realice un seguimiento de la evolución del anillo ANXA después de la punción de la membrana termoplasmónica mediante el flujo de trabajo de análisis de MATLAB del paso 5.1. Analice puntos de tiempo consecutivos para supervisar los cambios a lo largo del tiempo, como se muestra en la figura 3D, G, H.

Representative Results

En el presente estudio, se utiliza el método termoplasmónico para investigar la respuesta de la proteína anexina a la disrupción de la membrana plasmática; Sin embargo, cualquier proteína que pueda ser reclutada tras una lesión en la membrana puede ser investigada utilizando este ensayo, dado que la proteína respectiva está marcada con fluorescencia. El reclutamiento y la función de las proteínas se controlan mediante imágenes confocales tanto en células embrionarias humanas de riñón (HEK293T) como en vesículas unilamelares gigantes (GUV). Para elaborar, la Figura 2 ilustra las condiciones experimentales en las que se utiliza un rayo láser NIR enfocado a 1064 nm para irradiar un solo AuNP (Figura 2A), lo que resulta en una lesión en la membrana y una afluencia de Ca2+ en la célula, activando la maquinaria PMR. Posteriormente, las anexinas se reclutan rápidamente en el sitio de la lesión, donde se unen a los fosfolípidos cargados negativamente en el perímetro de la herida, formando una estructura en forma de anillo en cuestión de segundos (Figura 2B, i-iv). Los experimentos de membranas modelo, utilizando GUV, demostraron que las punciones de la membrana se volvieron a sellar rápidamente en ausencia de ANXA, como se muestra en la Figura 2C. Sin embargo, en presencia de ANXA, se observó una rápida acumulación de ANXA en el sitio de la lesión después de la punción de la membrana (Figura 2D). En particular, ANXA continuó rodando los bordes expuestos, lo que finalmente llevó a la explosión del GUV. Se cree que este mecanismo de rodadura surge de la capacidad de ANXA para inducir curvatura y doblar las membranas lipídicas20. Figura 2: Respuesta de las anexinas (ANXAs) a la disrupción de membrana inducida por termoplasmónica. Inicialmente, (A) la membrana plasmática actúa como una barrera entre el entorno extracelular que contiene altos niveles de iones Ca2+ y el entorno intracelular con ANXAs encapsulados. Tras la irradiación con un láser de infrarrojo cercano (NIR), el AuNP genera un calor sustancial, lo que hace que la membrana se rompa y provoque una afluencia de iones Ca2+. En consecuencia, se activa la maquinaria de reparación de la membrana plasmática (PMR), que implica el reclutamiento de ANXAs al sitio de la lesión, donde se unen a los fosfolípidos cargados negativamente. (B-D) Las imágenes de microscopía confocal de una célula que contiene ANXA2 y una GUV que contiene ANXA4 demuestran este proceso. (i) Antes de la irradiación, las imágenes muestran una célula intacta, o GUV, con los sitios de irradiación indicados por las flechas blancas. (ii) Tras la irradiación de nanopartículas, (B) las ANXA se reclutan rápidamente en el sitio de la lesión, formando una estructura en forma de anillo alrededor de la herida de la membrana (B [ii-iv]). El panel (C) muestra un GUV teñido de membrana sin ANXA, que, al punción, se vuelve a sellar rápidamente sin remodelación observable de la membrana. Por otro lado, el panel (D) muestra un GUV que contiene ANXA4 recombinante, que ya está unido a la membrana antes de la irradiación (i) debido a la fuga de Ca2+ a través de la membrana. (ii) Tras la punción, ANXA4 se une a los bordes libres, lo que hace que el GUV colapse a medida que la membrana se aleja del borde. Las barras de escala miden 10 μm para la figura (B), 2 μm para B (i), 10 μm para (C) y 15 μm para (D). Esta figura se reproduce de Moreno-Pescador et. al16 con permiso de la Royal Society of Chemistry. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. El análisis de las estructuras completas en forma de anillo ANXA (Figura 2B y Figura 1 suplementaria) proporciona información útil sobre el tamaño y la morfología de la herida. El radio de la estructura del anillo ANXA se puede determinar a lo largo del tiempo y el espacio, como se describe en la Sección 5. Moreno et al.16 analizaron más de 135 lesiones de membrana plasmática en células vivas, donde el análisis de las estructuras de los anillos ANXA5 se muestra en la Figura 3. El radio se determinó midiendo la distancia desde el centro del anillo hasta el radio externo de la curva en función del máximo de la mitad del ancho total del perfil de intensidad colapsado (Figura 3A). Los hallazgos ilustraron una distribución heterogénea de los tamaños de los anillos ANXA5 (Figura 3B), que se mantuvieron constantes a lo largo del tiempo (Figura 3D, G, H) y el espacio (Figura 3C, E, F). Estos resultados sugieren una acumulación de ANXA5 alrededor de los sitios de lesión, lo que indica una estrategia de PMR mediada por ANXA5 alternativa en células vivas a la hipotética gemación interna en forma de embudo de la membrana dañada5. Figura 3: Análisis de las estructuras de los anillos ANXA5 que rodean un sitio de lesión en células vivas. (A) La representación esquemática ilustra el enfoque analítico, que se basa en el máximo de la mitad de la anchura completa del perfil de línea de intensidad ANXA. (B) El histograma ilustra 135 radios de anillo ANXA5 medidos. (C) Perfiles de línea de intensidad de fluorescencia a través de un anillo ANXA5-GFP para cada sección z de la pila z. (D) Las imágenes confocales ilustran la evolución temporal de una herida, donde ANXA5-GFP se acumula en el perímetro de la herida inmediatamente después de la lesión, seguida de la estabilización de la herida. Los fotogramas de tiempo etiquetados del 1 al 6 se capturaron a intervalos de 0,66 s por fotograma. La barra de escala es de 2 μm. (E) Los radios de las heridas se determinaron en función de la profundidad de la herida según el método presentado en el panel A. (F) La pendiente de la herida se analizó como radios de anillo ANXA5 en función de la altura z en función de los datos extraídos del panel E. (G) Los perfiles de la línea de intensidad de fluorescencia se midieron a través del anillo ANXA5-GFP del panel D, donde cada intervalo de tiempo 1-6 se denota como segmento 1-6. Finalmente, (H) la evolución temporal de los radios de anillo ANXA5-GFP se presenta en función del tiempo calculado a partir de los datos del panel G. Esta figura se reproduce de Moreno-Pescador et. al16 con permiso de la Royal Society of Chemistry. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. En comparación con las estructuras en forma de anillo formadas por la interrupción de la PM sola (Figura suplementaria 1), las lesiones en las proximidades del núcleo (Figura suplementaria 2A) pueden influir en la evolución y geometría de la herida. En ocasiones, solo una fracción de los anillos ANXA eran evidentes (Figura suplementaria 2B,C), que también se pueden analizar utilizando el flujo de trabajo de análisis interno de MATLAB (consulte la Sección 5), aunque es posible que se pierdan datos adicionales. Típicamente, las formaciones de anillos ANXA observadas en células no adherentes (Figura suplementaria 2C) se localizan cerca tanto del núcleo como de la periferia de la célula. Como consecuencia, se puede observar una estructura de anillo más alargada, que no es óptima para el análisis de datos presentado. Además, las células no adherentes parecían ser más susceptibles a la muerte celular después de la lesión por PM. Además, al considerar las lesiones resultantes de la irradiación de los agregados de AuNP, es importante tener en cuenta que estas lesiones pueden ser más graves y menos controlables. Esto se debe al aumento significativo del calentamiento plasmónico, que puede dañar una gran fracción de la célula. Como resultado, tales lesiones no se han incorporado en el análisis del anillo ANXA5. Además, los resultados preliminares indican que la disrupción de la membrana plasmática mediante termoplasmónica da lugar a niveles elevados de Ca2+ intracelular. Esto se observó incluso en la irradiación de baja intensidad de AuNPs individuales, lo que sugiere una permeabilización de PM35, como se muestra en la Figura 4. La afluencia de Ca2+ se observó en células que expresan una sonda de calcio unida a la membrana, GCaMP6s-CAAX, que sufre un cambio conformacional con la afluencia de Ca2+ , por lo que se puede observar un aumento en su intensidad64. La intensidad de calcio se cuantificó para toda la huella de la célula a lo largo del tiempo. Para eliminar el ruido de fondo, se restó el nivel de Ca2+ de fondo antes de la disrupción de la membrana y la reparación posterior a la membrana. La intensidad máxima se determinó normalizando la intensidad media de Ca2+ dentro de la célula, lo que dio como resultado una curva de intensidad que exhibía un rápido aumento inicial de la intensidad de Ca2+ seguido de una disminución más lenta, como se muestra en la Figura 4B. La célula alcanzó una intensidad máxima de calcio a ~ 6,6 s, lo que es consistente con los hallazgos de Klenow et al.64, quienes sugirieron que el tiempo del pico de intensidad de calcio (t = tc) corresponde al tiempo requerido para el cierre de la herida. Sin embargo, aunque se requieren más investigaciones para establecer el mecanismo subyacente de la reparación de la membrana y la cicatrización de heridas, los hallazgos preliminares mostraron que este proceso de Ca2+ se observó exclusivamente en la célula lesionada y no en la célula no lesionada utilizada como control positivo. Esto confirma que la célula experimentó una afluencia de Ca2+ tras la ruptura de la membrana termoplasmónica, donde el exceso de calcio intracelular se bombea activamente después de una PMR exitosa, ya que el nivel de calcio intracelular ya no compite con la afluencia de Ca2+ , logrando finalmente la homeostatsis celular64. Figura 4: La entrada de calcio se produce cuando la membrana plasmática de una célula HEK293T se rompe por termoplasmónica. Una serie de imágenes confocales muestran dos células (la célula de interés y una célula no lesionada utilizada como control positivo) que expresan la sonda de calcio unida a la membrana, GCaMP6s-CAAX. La barra de escala mide 10 μm. (A) Antes de la irradiación, a las 00:00 s, la huella de las dos células se visualiza mediante la línea de puntos gris, y el sitio de irradiación se indica mediante el círculo amarillo. Tras la irradiación láser, se observa una rápida afluencia de Ca2+ , que alcanza la intensidad máxima a ~ 6,6 s, denotada por la línea discontinua naranja, un punto de tiempo que se supone que corresponde al momento del cierre de la herida64. (B) El perfil de intensidad de calcio obtenido de la sonda GCaMP6s-CAAX en la célula lesionada (línea azul) se comparó con la intensidad de Ca2+ en una célula vecina no lesionada (línea punteada gris), mostrando una clara afluencia de Ca2+ exclusivamente tras la interrupción de PM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El estudio destaca el enfoque termoplasmónico como una técnica prometedora para explorar las respuestas de las proteínas en células vivas y modelar membranas después de la ruptura de la membrana. Este método no solo proporciona amplia información sobre el reclutamiento de proteínas, sino también sobre la función biofísica de las proteínas involucradas en la dinámica proteína-membrana. En consecuencia, facilita la identificación de los componentes moleculares responsables de la reparación de la superficie y avanza en la comprensión de la compleja pero vital maquinaria de la reparación de la membrana plasmática. Aunque existen varios métodos para inducir la disrupción de la membrana, como técnicas mecánicas, químicas y ópticas, estos métodos sufren de limitaciones, como no ser específicos de las células, generar múltiples lesiones en la membrana celular o causar un daño significativo a la membrana y ablar el material celular interno a lo largo de la trayectoria del láser cuando se utilizan láseres pulsados de alta potencia. Si bien la integración de la microscopía confocal y las pinzas ópticas ofrece la información más completa, también se podrían utilizar modalidades de imagen alternativas. Por ejemplo, dado que la obtención de imágenes de la nanopartícula plasmónica se consigue mediante microscopía de reflexión, un modo de imagen incorporado en los microscopios confocales Leica, se podrían emplear técnicas de imagen adicionales, como la microscopía de campo oscuro^65,66, otros métodos de dispersión como iSCAT^67,68 o el marcaje fluorescente de la nanopartícula, para la visualización de AuNP, aunque esto podría limitar la aplicabilidad del método.

El método presentado también es capaz de inducir agujeros nanoscópicos en membranas modelo, lo que permite investigar los efectos de sinergia entre diferentes anexinas. Esto se logra encapsulando anexinas recombinantes marcadas de manera diferente, por ejemplo, RFP y GFP, respectivamente, seguidas de punción termoplasmónica. Este sistema modelo proporciona información sobre cómo interactúan las anexinas con las membranas en las proximidades de los bordes libres, como se muestra en la Figura 2D. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en las células, los agujeros infligidos a los GUV continúan expandiéndose, seguidos de la desestabilización de la vesícula. La obtención de imágenes de la evolución del agujero mediante microscopía confocal puede ser un reto debido a la rápida expansión del diámetro del agujero, pero puede lograrse capturando varias pilas z a lo largo del tiempo. Un método alternativo sería utilizar un disco giratorio confocal para obtener imágenes más rápidas. Además, el enfoque termoplasmónico suele producir un número limitado de resultados óptimos por hora cuando se aplica a células individuales o experimentos GUV, generalmente de dos a tres, a temperaturas de muestra entre 20 °C y 30 °C. Para obtener la observación más precisa de la dinámica proteína-membrana, se recomienda mantener las células en un tampón que contenga HEPES y reemplazar la muestra cada hora. Alternativamente, la ventana experimental podría ampliarse realizando los experimentos en una cámara de incubación celular, es decir, a una temperatura constante de 37 °C con 5% de CO₂. Además, la combinación de este enfoque con otras técnicas de imagen, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), podría proporcionar una comprensión más profunda de la función biofísica y la interacción de proteínas clave involucradas en la reparación de la membrana a nivel de una sola molécula. Esto podría proporcionar información detallada sobre el sitio de la lesión, incluida la geometría de la herida y la ubicación de las proteínas de anexina, así como identificar otros actores clave involucrados en la reparación de la superficie de la membrana.

Con el fin de lograr la máxima eficacia y precisión en la inducción de lesiones en la membrana, es imperativo verificar la ubicación del foco láser antes de cada experimento y asegurarse de que la posición axial del foco láser coincida con el foco confocal. Esta alineación optimiza la intensidad durante la obtención de imágenes de AuNP, lo que conduce a un aumento máximo de la temperatura local y la consiguiente lesión de la membrana a una potencia láser más baja. Este proceso se ejecuta manualmente y, por lo tanto, es susceptible a la variabilidad en la eficiencia de ruptura de la membrana, ya que el foco se traslada manualmente a una posición que coincide con la ubicación de la partícula. En los microscopios que carecen de un modo de reflexión, como en algunos sistemas comerciales, la colocalización del foco láser y la partícula puede ser un desafío. En tales casos, se pueden emplear modos de imagen alternativos (por ejemplo, campo claro) y se puede realizar un escaneo ráster lento alrededor de la posición esperada de la partícula. Cabe señalar que es probable que la baja potencia del láser induzca solo la permeabilización de la membrana, mientras que la alta potencia del láser puede generar temperaturas alrededor del NP que exceden el punto de ebullición del agua, incluso si la superficie del vidrio tiene un efecto de enfriamiento. Se estima que la formación de nanoburbujas alrededor de las NPs ocurre entre 200 °C y 300 °C^25,48, donde el calor explosivo puede resultar en el desplazamiento de partículas del foco láser o en la fragmentación de partículas. Además, la formación de nano o microburbujas durante el calentamiento supone un reto para este método. Dado que las interfaces de aire deshumedecen las membranas y pueden causar la desestabilización de las proteínas, lo cual no es deseable, es imperativo limitar el calentamiento cuando se investiga la reparación de la membrana. En particular, las nanocapas de oro no toleran altas temperaturas y se degradarán en estas condiciones, como lo demuestra la microscopía de alta resolución⁵⁸.

Este artículo proporciona un protocolo detallado para el uso de termoplasmónica para realizar punciones altamente localizadas en membranas, que es aplicable tanto a células como a membranas modelo. Para reducir aún más el grado de calentamiento, se pueden utilizar nanopartículas más pequeñas que resuenan con la luz NIR, lo que permite punciones intracelulares en los endosomas, el retículo endoplásmico y la envoltura nuclear. Estas nanopartículas, incluidos los bastones y las nanomatrioskas⁴⁸, pueden utilizarse para investigar la reparación de la envoltura nuclear dirigiéndose a las nanopartículas de oro endocitadas que se absorben fácilmente en la superficie celular y se dirigen hacia el núcleo⁶⁹. En general, esta técnica permite identificar y examinar los componentes moleculares clave implicados en la PMR, dilucidando su función biofísica y su papel, preservando al mismo tiempo la viabilidad de las células.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer a Jesper Nylandsted por proporcionarnos proteínas de anexina recombinantes y plásmidos que codifican para las anexinas. Este trabajo fue financiado por el Consejo Danés para la Investigación Independiente, Ciencias Naturales (DFF-4181-00196), por el Programa de Sinergia Interdisciplinaria de la Fundación Novo Nordisk 2018 (NNF18OC0034936), el Comité Científico de la Sociedad Danesa del Cáncer (R90-A5847-14-S2), la Fundación Lundbeck (R218-2016-534) y por el Centro de Excelencia de la Fundación Lundbeck (Biomembranas en Nanomedicina).

Materials

1064 nm trapping laser	Spectra Physics	N/A	Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold Nanoshells	NanoComposix	NCXGSIR150
200 nm Gold Nanoparticles	BBI Solutions	EM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwell	MATTEK	P35G-1.5-14-C
Amber-glass vials	Supelco Sigma Aldrich	243438
Annexin A2 plasmids	N/A	N/A	Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein	N/A	N/A	N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein	N/A	N/A	N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-casein	Sigma Life Science	C6905-1G
CaCl₂	Suprlco (sigma Aldrich)	10035-04-8
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702
Chloroform	VWR Chemicals	67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface)	Thermo scientific	150460
DID cell-labelling Solution	Invitrogen	7757
Distilled water	Gibco	15230-089
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C	Dissolved in chloroform
DOPS	Avanti Polar Lipids	840035C	Dissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's Medium	Thermo Fisher Scientific	11995065
FIJI ImageJ distribution	ImageJ2	N/A
GCaMP6s-CAAX		N/A	Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	11573397	10% of the culture medium
Glucose	PROLABO	24 374.297
Hamilton syringes	Hamilton Company	N/A	50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002	Harrick Plasma	N/A
HEK293T cells		N/A	Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS)	Leica	N/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2	Leica	N/A
Leica SP5 confocal scanning microscope	Leica	N/A
Lipofectamine	Fisher Scientific	15338030
MatLab	The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States	N/A
NaCl	VWR Chemicals	7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	11058021
Parafilm	Bemis	PM-992
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	1% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20)	Physik Instrumente (Germany)	N/A
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920-100ML	0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcohol	Sigma-Aldrich	363065-25G
round glass slide 25 mm Ø	VWR	631-1584
Sonicator Brandson 2800	Brandson	N/A
sucrose	Sigma Life Science	57-50-1
T25 tissue culture flask	Falcon	353108	Blue Vented cap
Tris-HCl	Invitrogen	15567-027
TrypLE	Thermo Fisher Scientific	A1285901
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	11590626
VWR Mixer mini vortex 230V EU	VWR	12620-84	ECN: 444-2790, SN: 150713022

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Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., Moreno-Pescador, G., Bendix, P. M. A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes. J. Vis. Exp. (203), e65776, doi:10.3791/65776 (2024).