A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

Helena Maria D. Danielsen; Mohammad Reza Arastoo; Guillermo Moreno-Pescador; Poul Martin Bendix

doi:10.3791/65776

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生物学

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법

Published: January 19, 2024

doi:

10.3791/65776

Helena Maria D. Danielsen¹, Mohammad Reza Arastoo¹, Guillermo Moreno-Pescador^1,2, Poul Martin Bendix¹

¹The Niels Bohr Institute,University of Copenhagen, ²Department of Plant and Environmental Sciences,University of Copenhagen

Summary

열플라즈몬 천공법은 공초점 현미경, 광학 핀셋 및 금 나노 입자를 통합하여 세포 및 거대 단층 소포에서 원형질막 복구 중 단백질 반응을 연구합니다. 이 기술은 빠르고 국소적인 막 천자를 가능하게 하여 복잡한 원형질막 수리 기계에서 주요 단백질과 그 기능적 역할을 식별할 수 있습니다.

Abstract

세포막은 세포의 생존에 매우 중요하며, 세포가 전체 수명 주기 동안 손상을 입기 때문에 세포막의 무결성을 보장하는 것이 필수적입니다. 세포막의 손상을 방지하기 위해 세포는 효율적인 원형질막 복구 메커니즘을 개발했습니다. 이러한 복구 메커니즘은 공초점 현미경과 나노 스케일 열플라즈모닉스를 결합하여 살아있는 세포 및 막 모델 시스템의 표면 복구에 관여하는 아넥신과 같은 주요 단백질의 역할을 식별하고 조사함으로써 연구할 수 있습니다.

천공 방법은 레이저를 사용하여 나노 입자 조사 시 고도로 국부적인 가열을 유도합니다. 근적외선을 사용하면 생물학적 시료의 광독성을 최소화할 수 있으며, 대부분의 흡수는 근적외선 공명 플라즈몬 나노 입자에서 이루어집니다. 이 열플라즈몬 방법은 소포 및 세포 융합 연구를 통해 세포 내 메커니즘 및 세포 반응에 대한 이해를 높이기 위한 잠재적인 광열 및 생물물리학 연구에 활용되었습니다. 이 접근법은 기계적, 화학적 또는 광학적 유도 부상과 같은 기존 막 파괴 방법을 보완하는 것으로 나타났으며 극도로 국소적인 부상을 입혀 높은 수준의 제어를 제공합니다. 손상의 정도는 구형 나노 입자 부근으로 제한되며 다른 파장을 사용하는 펄스 레이저와 달리 빔 경로를 따라 유해한 손상이 발생하지 않습니다. nanobubbles의 대형과 같은 특정 한계에도 불구하고, thermoplasmonic 방법은 세포 생존력을 타협하기 없이 거의 본래 환경에 있는 원형질막 수선에 있는 세포질 반응을 조사하기를 위한 유일한 공구를 제안합니다.

공초점 현미경과 통합될 경우, 천공 방법은 모델 멤브레인 시스템의 멤브레인 역학에 대한 기계론적 이해뿐만 아니라 단백질 모집 및 생물물리학적 기능을 포함하여 멤브레인 손상에 대한 단백질 반응에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있습니다. 전반적으로, 이 방법을 축소된 모델 시스템에 적용하면 살아있는 세포의 복잡한 원형질막 복구 기계에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

Introduction

물리적 장벽과 신호 전달 플랫폼 역할을 하는 세포막은 세포 생존에 매우 중요합니다¹. 전체 세포 주기에 걸쳐 원형질막(PM)은 기계적 ^2,3,4,5 및 화학적 ⁶ 응력 유발 손상과 같은 손상을 입습니다. 세포막 무결성을 유지하고 세포 생존을 보장하기 위해 세포는 강력한 원형질막 복구(PMR) 메커니즘을 개발했습니다. 이러한 메커니즘은 세포골격 재구성, 막 융합 및 막 교체 전략 7,8,9,10,11과 같은 다양한 전략에 의존하며, 모두 특정 단백질의 모집에 의존합니다. 특히, 아넥신 단백질 계열의 구성원은 PMR 1,9,12,13,14,15,16의 과정과 관련된 핵심 단백질로 확인되었습니다. 미세먼지가 손상되면 세포는 칼슘 이온(Ca²⁺)의 유입을 경험하게 되는데, 이는 세포의 생존에 즉각적인 위협이 된다¹⁷. Ca²⁺ 유입에 대한 반응으로, 주로 세포질에 위치한 아넥신 단백질은 PMR 전략¹⁸의 일부로 손상된 원형질막의 내부 엽단에 결합합니다. 아넥신 A2(ANXA2)는 디스페린 결핍성 근이영양증에서 PMR과 관련된 아넥신 계열의 첫 번째 구성원 중 하나였으며 손상 부위 5,19,20,21 근처의 PM에 세포내 소포를 융합하여 수리를 중재하는 것이 제안되었습니다. 그 후, 여러 기능이 부속서²²에 기인했으며, PMR에서의 역할은 지난 20년 동안 더 많은 관심을 끌었습니다. 그러나 PMR에서 아넥신의 정확한 역할은 완전히 이해되지 않은 채로 남아^있다 15,18,21,22.

이 기사에서는 공초점 현미경, 광학 핀셋 및 금 나노 입자(AuNP)의 조합을 활용하여 제어되고 고도로 국소화된 방식으로 단백질-막 상호 작용 및 막 역학을 조사하는 방법을 제안합니다. 이 방법을 사용하면 막 손상 및 Ca²⁺ 유입에 대한 반응으로 단백질, 지질 및 소분자 상호 작용에 대한 정량적 연구를 수행할 수 있습니다. 막 수리 과정에 관련된 구성 요소의 복잡성과 다양성에도 불구하고, 원형질막을 모방한 단순화된 막 시스템은 막 역학 및 막 파괴에 대한 부속 단백질의 반응에 대한 더 깊은 기계론적 이해를 얻기 위해 사용되었습니다¹⁶. 거대 단층 지질 소포(GUV)는 지정된 지질 조성을 가진 모델 막 시스템으로 선택되었습니다. GUV는 Weinberger et ^al.23에 의해 기술된 바와 같이 겔 보조 수화 방법, 특히 폴리비닐 알코올 겔 수화를 사용하여 생성되었으며, 이를 통해 GUV에 부속서를 효율적으로 캡슐화할 수 있었습니다.

금속 나노 입자 (NP)에 근적외선(NIR) 레이저 조사를 활용하면 NP의 상당한 가열이 유도되어 생물 의학 응용 분야에서 활용되는 국부 열원을 설정하는 효과적인 방법이 됩니다²⁴. 이 방법은 처음에 2D 및 3D 생체 모방 분석에서 단일 AuNP를 둘러싼 온도를 직접 측정하는 데 사용되었습니다. 이러한 분석법^25,26에서, 플라즈몬 나노 입자는 지지된 지질 이중층에 조사되거나 국부 가열 시 국부적인 열상 전이를 겪는 GUV 근처에 광학적으로 포획되어 입자 주변의 정확한 온도 프로파일을 정량화하고 제어할 수 있습니다. 이 기준 온도 프로파일은 생물학적 표본을 조사하거나 조작할 때 활용되었습니다. 상기 방법의 추가적인 발전은 막(²⁷)에서 나노스코픽 공극의 유도를 용이하게 하여, 소포 및 세포 융합(^28,29)을 가능하게 하였다. 다른 연구에서는 새로운 하이브리드 소포를 만들어 GUVs²⁹ 및 막관통 단백질(³⁰)에서 말초막 단백질의 거동을 조사했으며, 세포 특이적 약물 전달도 세포 반응 또는 유전자 발현을 제어하고 연구하기 위해 탐구되었습니다 28,29,31,32,33. 최근에, 방법은 막 손상 32,34,35에 단백질 반응을 조사하기 위하여 이용되었다.

세포 반응과 막 복구를 탐색하기 위해 원형질막을 파괴하는 몇 가지 방법이 있습니다. 여기에는 마이크로니들 천자, 마이크로비드 쉐이킹, 세포 긁기 등이 포함되며, 이 모든 것들은 세포막을 기계적으로 파괴할 수 있다 14,36,37. 화학적으로 유도된 손상은 지질 이중층을 불안정하게 만들고 원형질막을 가로질러 막 공극을 생성하는 세제⁽^5,38) 또는 박테리아 독소^(39,40)를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 또한, 연속파 및 펄스 레이저에 의한 광학적으로 유도 된 손상은 플라즈몬 나노 입자 42,43,44,45와 함께 아 넥신 단백질 5,14,21,41과 같은 PMR 구성 요소를 연구하는 데 사용되었습니다 . 고출력 펄스 레이저의 효율성에도 불구하고 빔 경로를 따라 셀 내부에 심각한 부상과 손상을 일으킬 수 있습니다. 또한, 펄스 레이저 조사 시 생물학적 물질에서 발생하는 자세한 변화와 잘 정의된 기공을 생성하는지 여부는 추가 조사가 필요합니다. 대안적인 방법은이 기사에서 제시되며, 열플라즈모닉스를 사용하여 내부 구조에 심각한 해를 끼치 지 않고 제어 된 방식으로 PM의 나노 정공을 유도합니다^34,35. 이는 플라즈모닉 NP를 고도로 집중된 NIR 레이저에 노출시킴으로써 달성되며, 그 결과 200°C를 초과하는 온도에 쉽게 도달할 수 있는 극도로 국부적인 온도 증가가 발생하여 작은 나노 폭발을 일으킬 수 있습니다 25,46,47. 이 과정은 레이저 강도뿐만 아니라 NPs(⁴⁸)의 크기, 형상 및 구성을 조절함으로써 제어될 수 있다. 이 기술을 사용함으로써 연구자들은 살아있는 세포의 PM 복구에서 단백질의 역할을 탐구할 수 있으며, 이는 세포 생존력을 손상시키지 않으면서 막 복구에 있는 annexin 단백질의 관여에 관한 답이 없는 질문 중 일부를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

플라즈몬 나노 입자의 광학 트래핑은 이전 연구 25,49,50,51,52에 의해 잘 확립되었습니다. 그러나, 나노입자(53,54,55)의 열플라즈몬 특성에 관한 추가적인 통찰은 보충 자료(보충 파일 1)에서 얻을 수 있다. 열플라즈몬 방법은 세포 반응 및 복구 메커니즘을 연구하기 위해 PM에 나노 구멍을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 보다 정확하게는, 천공은 그림 1A 및 B와 같이 멤브레인에 근접한 AuNP의 광학 가열을 통해 달성될 수 있습니다. 이 국부적인 펑크는 칼슘 센서에 의해 확인된 Ca²⁺ 유입을 허용하여 PMR 기계를 활성화합니다. 살아있는 세포 실험의 경우, 직경 200nm의 AuNP를 세포 아래 표면에 고정시켜 공초점 현미경을 통해 PMR에서 ANXA2의 역할을 모니터링했습니다. 파장이 1064nm인 NIR 레이저(그림 1A,B)는 AuNP를 조사하여 플라즈몬 특성(그림 1C)을 이용하여, 세포 자체에 최소한의 손상을 입히면서 생물학적 투명성 창(⁴⁹)에서 상당한 국부 가열(그림 1D)을 초래합니다. AuNP를 둘러싼 고온 영역은 그림 1E에 표시된 바와 같이 NP의 반경에 해당하는 거리에서 30-40%까지 급격히 감소하여 3차원 모두에서 극도로 제한된 부상을 허용합니다.

보충 파일 1. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1: 실험 방법의 개략도. (A) ANXA 형질주입된 세포는 표면의 고정된 금 나노입자(AuNP) 위에 위치하거나, (B) 캡슐화된 ANXA가 있는 거대 단층 소포(GUV)가 AuNP를 포함하는 배지에 현탁되어 있습니다. (C) 단일 AuNP는 NIR 광학 트랩에 의해 조사되며, 여기서 들어오는 전자기장과 전도 전자 사이의 상호 작용은 NP 내에서 전자의 집단 진동으로 이어집니다. (D) 이 과정은 매우 제한적이지만 상당한 온도 상승을 초래합니다. NP 표면의 온도를 추정하기 위해 Mie 이론을 사용하고 직경이 200nm이고 레이저 강도 I = 6.36 x 10^8W/^cm2인 AuNP에 대해 (E) 온도 프로파일을 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포막에 대한 열 효과를 최소화하기 위해 AuNP는 ~1초 동안만 조사됩니다. 이로 인해 일시적이고 국부적인 가열이 발생하여 일반적으로 풀리는 데 더 많은 시간이 필요한 단백질의 손상을 줄입니다. 막에 구멍이 뚫리면 아넥신 단백질이 순식간에 모집되고 몇 초 내에 아넥신 고리 모양의 지지대가 손상 부위 주위에 형성됩니다(그림 2). 이 접근법은 또한 복구 과정의 전체 계획을 밝히기 위한 노력의 일환으로 살아있는 세포와 모델 막¹⁶ 모두에서 ANXA5의 관여를 탐구하는 데 적용되었습니다. 주요 초점은 다양한 annexin 단백질의 상관 모집에 있었지만 복구 메커니즘의 생물 물리학적 측면은 아직 설명되지 않았습니다.

제안된 방법을 완전히 구현하려면 공초점 현미경, 광학 핀셋 및 금속 나노 입자의 세 가지 핵심 구성 요소가 필요합니다. 광학 핀셋은 AuNP를 포획하는 데 사용되며 Neuman et ^al.49에 설명된 절차에 따라 구성할 수 있습니다. 그러나 광학 핀셋을 만드는 것이 너무 어려운 것으로 판명되면 조밀하게 집중된 NIR 레이저를 사용하여 세포 아래에 고정된 AuNP를 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 구형 AuNP가 선택되었지만, 조정 가능한 흡수 스펙트럼을 갖는 다양한 플라즈몬 입자를 이용하여 NIR 영역⁽⁴⁸) 내에서 고도로 국소화된 온도 구배를 달성할 수 있습니다.

형광 이미징은 형광 표지된 단백질의 역할을 관찰하는 데 필요하므로 전반사 현미경(TIRF)⁵⁶ 은 컨포칼 이미징의 대안으로 간주될 수 있습니다. 그러나 이 기술은 표면 이미징만 허용하며 모델 막 소포 실험과 호환되지 않습니다. 결과적으로, 광학 핀셋과 컨포칼 현미경은 모두 나노 입자의 정확한 위치 파악과 세포 손상을 둘러싼 국소 부위의 상세한 조사에 필수적입니다. 회절 제한 레이저 초점으로 나노 입자를 효과적으로 조사하려면 나노 입자를 시각화해야 합니다. 이는 라이카 컨포칼 현미경의 표준 이미징 기능인 반사 현미경을 통해 최적으로 달성할 수 있습니다. 그러나 반사 또는 산란 이미징을 사용할 수 없는 경우 효율성이 떨어지는 형광 AuNP 라벨링과 같은 대체 방법을 고려할 수 있습니다.

요약하면, 이 연구에서 제시된 고도로 제어 가능하고 국소화된 열플라즈모닉 방법은 살아있는 세포의 세포 반응 및 PM 복구 메커니즘과 관련된 분자 구성 요소를 조사하기 위한 훌륭한 플랫폼 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. PM 손상 시 단백질 반응을 연구하는 것 외에도 이 접근법은 국소적으로 소포에 구멍을 뚫는 데에도 활용할 수 있으므로 단백질-단백질 및 단백질-막 역학 모두에서 단백질 반응을 조사할 수 있습니다. 또한, 이 방법을 사용하면 막이 파괴될 때 단백질, 지질 및 소분자 간의 상호 작용을 정량적으로 분석할 수 있습니다. 종합적으로, 이러한 발전은 복잡하고 복잡한 원형질막 수리 기계와 관련하여 해결되지 않은 몇 가지 질문에 빛을 비출 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

Protocol

1. 세포막 천자 준비 세포 파종(1일차)인간 배아 신장(HEK293T) 세포를 5% CO2 가습기 인큐베이터에서 37°C의 배양 배지에서 70% 밀도에 도달할 때까지 배양합니다. 500μL의 트립신을 사용하여 표면에서 세포를 분리하고 200,000개의 HEK293T 세포를 계수한 다음 총 부피가 3mL인 배양 배지에 파종합니다. 37°C에서 5%CO2 가습기 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.NOTE: 접시 중앙에 세포가 뭉치는 것을 방지하려면 세포를 고르게 벌리고 접시를 소용돌이치면 transfection 효율이 떨어질 수 있으므로 피하십시오. 세포 transfection(2일차)참고: transfection된 세포는 transfection 후 최대 48시간까지 사용할 수 있습니다.사용하기 전에 관심 플라스미드와 transfection 시약을 5초 동안 피펫으로 고정합니다. 멸균된 2mL 튜브에 500μL의 환원 혈청 배지, 5μL의 transfection 시약(플라스미드보다 4배 많음), 1.25μL의 플라스미드(1μg/μL)를 특정 순서로 혼합합니다.참고: 막 파열 시 칼슘 유입을 조사하려면 동일한 절차를 따르되 막 결합 칼슘 센서 프로브 GCaMP6-CAAX(1μg/μL)를 사용하십시오. transfection 혼합물을 부드럽지만 철저하게 피펫화하고 실온(RT)에서 30분 동안 배양한 후 세포에 적액합니다. 형질주입 혼합물을 추가하기 전에 배양 접시에서 배지를 제거하고 2mL의 인산염 완충 식염수로 세포를 부드럽게 세척한 다음 2000μL의 환원 혈청 배지를 접시에 추가합니다. 배지를 3mL의 배양 배지로 변경하기 전에 5% CO2 가습기 인큐베이터에서 37°C에서 5%CO2 가습기 인큐베이터에서 2시간 45분 동안 transfection 혼합물과 함께 세포를 배양합니다. 금 나노 입자 (AuNP) 용액의 제조 (2 일차)레벨 10에서 10초 동안 200nm AuNP 원액을 소용돌이치고(장치의 추가 사양은 재료 표 참조), 5분(최대 진폭) 동안 초음파 처리하고, 다시 10초 동안 소용돌이를 일으킵니다. 150μL의 AuNP와 850μL의 증류수를 총 부피 1mL로 혼합합니다.알림: 희석된 AuNP 용액은 냉장고에 보관하고 최대 1개월 동안 재사용할 수 있습니다. 실험 요리 준비 (2 일째)마이크로웰 접시에 150μL의 0.01%-0.1% 세포 부착 용액을 코팅하고 RT에서 15분 동안 배양합니다. 500μL의 증류수로 유리 표면을 두 번 세척하고 ~10분 동안 자연 건조시킵니다. 80μL의 AuNP 용액을 건조한 표면에 적가합니다.알림: AuNP 응집체를 최소화하기 위해 코팅된 유리 표면에 첨가하기 전에 묽은 AuNP 용액을 소용돌이(10초), 초음파 처리(5분) 및 소용돌이(10초)합니다. 1.5mL의 배양 배지를 도입하기 전에 ~10분 동안 기다립니다. 접시를 37°C에서 밤새 배양합니다. 실험실 준비(3일차)참고: 실험 챔버는 3일 또는 4일에 준비할 수 있습니다. 그러나 다음 준비는 실험과 같은 날에 수행되어야 합니다.배양 접시의 세포에서 배지를 제거하고 2mL의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척합니다.알림: 이 단계는 후속 단계를 방해할 수 있는 잔류 매체와 파편을 제거하는 데 필수적입니다. 500μL의 효소 기반 세포 분리 용액을 웰에 넣고 세포가 배양 접시에서 분리될 때까지 1-3분 동안 배양합니다. 1.5mL의 신선한 배양 배지를 추가하고 세포 용액을 피펫팅하여 균질한 세포 용액을 얻어 세포 클러스터의 가능성을 최소화합니다. 실험용 마이크로웰의 AuNP에서 배지를 조심스럽게 제거합니다. 세포 용액(2mL)을 마이크로웰에 넣고 실험을 수행하기 전에 최소 5시간 동안 배양합니다.알림: 최적의 실험 조건을 위해 챔버를 소용돌이치면 챔버 중앙에 세포가 뭉칠 수 있으므로 챔버를 소용돌이치지 마십시오. 2. 세포막 천자 실험 실험의 광학 설정1064nm 트래핑 레이저(57)와 결합된 컨포칼 스캐닝 현미경을 사용하여 실험을 수행합니다. 개구수(NA)가 1.2인 63x 수침 대물렌즈를 사용하여 초점면에서 광학 트래핑을 수행합니다. 초점이 Airy 디스크의 크기이고 조사 레이저의 초점 빔 폭이 반경이 ~540nm라고 가정합니다. 면적당 레이저 출력(W/cm2)을 계산하여 레이저 출력(P)을 해당 레이저 강도(I)로 변환합니다. 음향 광학 빔 스플리터(AOBS)를 활용하여 광전자 증배관을 사용하여 검출된 여러 형광 신호를 시각화하고 산란 신호를 통해 금속 NP를 동시에 검출합니다.참고: 모든 컨포칼 시스템에 금속 NP의 반사 이미징을 허용하는 AOBS가 장착되어 있는 것은 아닙니다. 여기에서 다른 형태의 검출을 구현하거나 셀 아래 영역에서 NIR 레이저의 순차적 스캔을 시도할 수 있습니다. 실험 세션 동안 현미경에 세포, 분자 형광 프로브 및 금 나노 입자가 들어 있는 유리 바닥 개방형 챔버를 장착합니다. 압전 스테이지에 장착된 샘플을 번역하여 세포에 대해 트랩을 이동시켜 나노미터 수준의 정밀한 측면 이동을 가능하게 합니다16.참고: 광학 트랩은 고정되어 있습니다. 세포막 천자에 대한 실험 설정형광 단백질과 결합된 annexin 플라스미드로 transfection된 HEK293T 세포를 유리 표면에 고정된 분리된 AuNP 위에 놓습니다(그림 1A). Argon 488nm 레이저를 사용하여 GFP 형광 신호를 시각화하고 HeNe 633nm 레이저를 사용하여 스캐닝 컨포칼 현미경에서 AuNP 반사를 관찰합니다. 1064nm NIR 레이저로 작동하는 광학 핀셋을 사용하여 ~1초 동안 단일 AuNP를 조사하여 원형질막을 파괴하는 상당한 국부적 온도 상승을 유도합니다. 초점이 맞춰진 입자에 200-295mW 사이의 방사선을 조사하여 상당한 온도 상승을 초래합니다.참고: 광학 장치 내에서 상당한 전력 손실이 발생하며, 초점의 레이저 출력은 특정 설정에 따라 명시된 밀리와트의 약 20%에 도달합니다. 특정 강도(W/cm2로 측정)는 시스템의 정확한 정렬, 특히 초점 크기에 따라 다릅니다. 또한, 유리의 열전도율은 셀과 물의 열전도율보다 높기 때문에 결과적으로 원형질막으로 방출되는 열의 양을 줄이면48,58이 약간 감소한다. NIR 레이저 초점 스폿의 국소화를 적절하게 보정하여 효과적이고 국소적인 미세먼지 손상 및 후속 단백질 복구 반응을 달성합니다. 이는 동일한 이미징 매체에 현탁된 단일 AuNP를 캡처하고 방사선 조사 전에 선택한 AuNP에 초점이 맞춰지도록 함으로써 달성됩니다.참고: 나노 입자는 공초점 현미경으로 관찰할 때 산란 신호가 가장 선명하게 나타날 때, 즉 가장자리가 선명하고 입자 주위에 후광이 없을 때 초점이 맞춰진 것으로 간주됩니다(그림 2C(ii)). 세포 및 AuNP 밀도 조건원형질막의 겹침을 방지하기 위해 세포 클러스터 대신 단일 세포를 선택합니다.알림: 세포는 표면에 부착되어 평평한 형태(보충 그림 1)를 나타내야 하며, 이는 핵 막의 손상을 방지하면서 세포 주변부에 구멍을 뚫을 수 있습니다(보충 그림 2). 프로토콜에 따라 또는 AuNP 세포 흡수를 방지하기 위해 침전되고 평평해질 때까지 세포를 배양합니다. PEGylated AuNP를 사용하여 과도한 배양 시간을 피하고 AuNP 세포내이입 가능성을 줄입니다. 고정된 AuNP가 응집체를 방지하기 위해 서로 적절한 간격으로 배치된 단일 입자로 존재하는지 확인합니다. 응집체는 열 구배를 크게 증가시켜 온도를 상승시켜 셀의 상당 부분을 방해할 수 있습니다. 세포 건강을 유지하기 위해 1-2시간마다 샘플을 교체하십시오.알림: 장기간 노출되면 세포 건강이 악화되어 막 복구 측면에서 손상에 정확하게 대응하는 능력이 저하될 수 있습니다. 이러한 세포 건강의 감소는 일반적으로 세포 모양의 변화로 관찰되며, 세포가 더 구형이고 더 단단하게 나타나 결국 세포 사멸로 이어집니다. 추가 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 3. 거대 단층 소포(GUV) 준비 지질 혼합물의 제조1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)과 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine(DOPS) 지질을 4:1의 몰비로 결합하여 GUV 지질 조성물을 만듭니다( 표 1 참조). 실험 요구 사항에 따라 지질 스톡을 1.5mL 유리 바이알에 분주하고 -20°C에서 보관합니다.알림: 지질을 장기간 보존하고 불포화 지질의 산화를 방지하려면 분취된 바이알의 공기를 아르곤으로 교체하십시오. 지질을 혼합하기 전에 클로로포름으로 50μL 및 500μL 유리 또는 금속 주사기를 5회 철저히 세척하여 클로로포름 용해 지질에 대한 오염 물질이 없는지 확인합니다.주의 : 클로로포름은 독성이 있으므로 흄 후드에서 취급하십시오.계산된 부피의 클로로포름을 깨끗한 호박색 유리 바이알에 옮긴 다음 지정된 양의 각 지질을 옮깁니다( 표 1 참조).알림: 지질 스톡 간의 교차 오염을 방지하려면 주사기를 클로로포름으로 세척해야 합니다. 마지막으로 멤브레인 염료를 추가하고 피펫팅으로 지질을 완전히 혼합합니다. 추가 사용을 위해 준비된 지질 혼합물을 -20°C에서 보관하십시오. 혼합물은 상당한 지질 손상 없이 2-3주 동안 생존 가능한 상태를 유지합니다.알림: 혼합은 금속 또는 유리 주사기로 수행해야 합니다. 지질이 냉동실에서 꺼낼 때는 항상 얼음 위에 보관하십시오. 폴리비닐알코올(PVA) 겔의 제조Weinberger et al.23에 의해 설명된 겔 보조 수화 방법을 사용하여 약간의 수정을 가하여 GUV를 준비합니다.50mM 자당, 25mM NaCl 및 25mM Tris(pH 7.4)를 포함하는 완충액 100mL에 PVA 5g을 용해시켜 PVA 겔을 준비합니다. PVA 용액을 85°C로 가열하고 투명해질 때까지 저어줍니다. RT로 식힌 후 나중에 사용할 수 있도록 냉장고에 보관하십시오.알림: PVA는 완충액에 제대로 용해되지 않으므로 최대 85°C까지 가열해야 합니다. 유리 슬라이드 준비유리 슬라이드를 에탄올로 청소하고 자연 건조시키십시오. 그런 다음 슬라이드를 공기 플라즈마 클리너로 처리하여 유리 표면에 남아 있는 오염을 제거합니다. PVA 코팅 유리 슬라이드 준비PVA 겔(5%)을 60°C까지 30분 동안 데우면 유동성이 높아집니다. 따뜻한 PVA 90μL를 유리 슬라이드에 바르고 균일하게 펴 바른 다음 50°C의 가열 캐비닛에서 50분 동안 건조시킵니다. PVA 유리 슬라이드가 준비되면 유리 또는 금속 주사기를 사용하여 준비된 지질 혼합물 30μL를 추가하고 바늘 가장자리를 사용하여 박막에 펴 바릅니다. 부드러운 질소 압력 하에서 클로로포름 함량을 증발시켜 지질 혼합물을 건조시킵니다. 또한 유리 슬라이드를 진공 상태에서 1.5-2시간 동안 건조시킵니다. 챔버에서 GUV 성장준비된 유리 슬라이드를 사용하여 이전에 출판된 보고서(59)와 유사한 디자인의 사내 챔버를 조립합니다. 별도의 2mL 튜브에서 관심 재조합 단백질(이 경우 ANXA5 또는 ANXA4)을 80mM 자당, 70mM NaCl 및 25mM Tris-HCl(pH 7.4)로 구성된 성장 완충액(GB)을 사용하여 최종 농도 500nM으로 희석합니다. 희석된 재조합 단백질 용액 400μL를 챔버에 추가합니다. GUV가 증착된 지질 코팅에서 성장할 수 있도록 상온에서 1시간 동안 챔버를 배양합니다. 단백질을 제외한 동일한 완충액을 음성 대조군으로 사용하십시오.알림: 버퍼 증발을 방지하기 위해 챔버를 폴리올레핀 필름으로 감쌉니다. 챔버 내용물 400μL를 2mL 튜브로 옮겨 GUV를 수집합니다. 수집된 용액에 55mM 포도당, 70mM NaCl 및 50mM Tris-HCl(pH 7.4)을 포함하는 관찰 완충액(OB) 1mL를 추가하여 GUV 외부의 캡슐화되지 않은 단백질을 제거합니다. 그런 다음 용액을 600 x g 에서 13°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액 1mL를 동일한 부피의 관찰 완충액으로 교체합니다. 부드러운 피펫팅을 통해 GUV를 분산시키고 GUV 실험에 사용될 때까지 냉장고에 보관합니다. 4. GUV 펑크 실험 챔버 준비실험에는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. GUV가 표면에 달라붙어 터지는 것을 방지하려면 β-카제인(5mg/mL)으로 15-30분 동안 표면을 코팅합니다.β-카제인 용액의 경우 20mM Tris(PH 7.5) 및 100mM NaCl의 20mL 완충액에 단백질 0.1g을 용해시킵니다. 단백질 용액을 여과하고 작은 바이알에 분주한 다음 나중에 사용할 수 있도록 얼립니다. 관찰 버퍼로 챔버를 두 번 세척하여 표면에서 과도한 유리 β-카제인을 제거하고 RT에서 건조시킵니다. 별도의 2mL 튜브에서 수집된 GUV를 OB와 혼합합니다. 원하는 최종 농도(이 경우 200μM)를 위해 혼합물에 CaCl2 를 추가합니다. 150nm 금 나노 쉘 (AuNS)을 1 : 100의 비율로 혼합물에 도입합니다. 최종 혼합물은 250μL의 GUV, 225μL의 OB, 20μL의 CaCl2 (5mM) 및 5μL의 지정된 AuNS로 구성됩니다. 실험 설정혼합물을 챔버로 옮기고 현미경 스테이지에 장착합니다. 챔버의 크기에 따라 혼합물 전체 또는 혼합물의 일부를 추가합니다.참고: 칼슘 이온이 막을 통과하여 막의 내부 전단에 대한 부속서의 결합을 중재할 수 있기 때문에 타이밍이 중요합니다. 세포 천공 실험에 사용된 것과 동일한 광학 설정을 사용합니다. 광학 핀셋을 사용하여 ~ 125mW의 레이저 출력을 적용하여 GUV 표면 또는 표면에 개별 AuNS를 가둡니다. 그런 다음 레이저 출력을 ~ 300mW로 높입니다. 이로 인해 고도로 국부적인 온도 상승이 발생하여 표적 부위의 멤브레인이 파괴되고 구멍이 뚫립니다.참고: AuNS는 고체 AuNP에 비해 더 작은 크기를 유지하면서 더 높은 과도 온도 상승을 생성할 수 있기 때문에 GUV 실험에 선호됩니다. 표 1: GUV 조성을 결정하기 위한 표. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 5. 세포 천자 실험에서 ANXA 반응의 측정 및 데이터 분석 MATLAB을 사용하여 영상을 분석하고 Mie의 방정식60,61을 기반으로 AuNP 온도 프로파일(그림 1D, E)을 계산하고 플로팅합니다. 또한, FIJI ImageJ 분포62,63을 사용하여 모든 공초점 영상을 처리합니다. ANXA 링 반경 계산멤브레인 손상 분석 전에 원시 데이터에서 천공 영역을 포함하는 관심 영역을 자릅니다. ANXA 링의 중심과 외부 둘레를 수동으로 표시하여 각 이미지를 처리하기 위해 사내 MATLAB 워크플로를 사용합니다.이러한 표시를 사용하여 관심 영역에 대한 처리 제한을 설정할 수 있습니다.참고: 영역은 이후에 설정된 한계 내에서 방사형으로 처리되며 중심까지의 특정 거리에서의 형광 강도는 동일한 중심 거리를 가진 전체 원에 대한 평균입니다. 이 숫자는 각 반경 단계에 대해 저장됩니다. 워크플로우를 사용하여 전체 스캐닝 범위에 걸쳐 평균 강도를 1차원 가우스 곡선에 맞추면 그림 3A와 같이 각각 Rext 및 Rint에 해당하는 최대값(RP) 및 FWHM(Full Width at Half Maximum)을 식별할 수 있습니다. 마지막으로, MATLAB 워크플로에 의해 생성된 플롯에 의해 주어진 링의 중심에서 Rext 까지의 거리로 ANXA 링의 반지름을 결정합니다. 3차원 ANXA 링 반경 계산5.1단계와 동일한 MATLAB 분석 워크플로를 사용하여 z 방향의 ANXA 링 반경의 변화를 추적합니다. 그림 3C, E에 설명된 대로 멤브레인 권선을 가로지르는 여러 컨포칼 z 절편에 워크플로우를 적용합니다. 그림 3F에 표시된 대로 z 단면에 대한 반경의 변화를 기반으로 각 상처의 기울기를 계산합니다. ANXA 링 반경의 시간 변화마찬가지로, 5.1단계의 MATLAB 분석 워크플로를 사용하여 열플라즈모닉막 천공 후 ANXA 링의 ANXA 링 진화를 추적합니다. 그림 3D, G, H에 설명된 대로 연속된 시점을 분석하여 시간 경과에 따른 변화를 모니터링합니다.

Representative Results

본 연구에서는 열플라즈몬 방법을 사용하여 원형질막 파괴에 대한 아넥신 단백질 반응을 조사합니다. 그러나, 막 손상에 모집될지도 모르다 어떤 단백질든지 각 단백질이 형광으로 레테르를 붙이다는 것을 주어진 주어진 이 분석실험을 사용하여 조사될 수 있습니다. 단백질 모집 및 기능은 인간 배아 신장(HEK293T) 세포와 거대 단층 소포(GUV) 모두에서 공초점 이미징으로 모니터링됩니다. 자세히 설명하자면, 그림 2 는 1064nm의 집중된 NIR 레이저 빔을 사용하여 단일 AuNP를 조사하는 실험 조건을 보여주며(그림 2A), 그 결과 멤브레인 손상이 발생하고 Ca2+ 가 셀로 유입되어 PMR 기계가 활성화됩니다. 그 후, 아넥신은 부상 부위에 빠르게 모집되어 상처 주변에서 음전하를 띤 인지질과 결합하여 몇 초 내에 고리 모양의 구조를 형성합니다(그림 2B, i-iv). GUV를 사용한 모델 멤브레인 실험은 그림 2C에 표시된 것처럼 ANXA가 없을 때 멤브레인 천공이 빠르게 재밀봉됨을 보여주었습니다. 그러나 ANXA가 있는 경우 막 천자 후 부상 부위에서 ANXA의 빠른 축적이 관찰되었습니다(그림 2D). 특히 ANXA는 노출 된 가장자리를 계속 굴려 궁극적으로 GUV의 파열로 이어졌습니다. 이러한 롤링 메카니즘은 곡률을 유도하고 지질막을 구부리는 ANXA의 능력으로부터 발생하는 것으로 여겨진다(20). 그림 2: 열플라즈몬 유도 막 파괴에 대한 Annexin(ANXA) 반응. 초기에 (A) 원형질막은 높은 수준의 Ca2+ 이온을 포함하는 세포외 환경과 캡슐화된 ANXA가 있는 세포내 환경 사이의 장벽 역할을 합니다. 근적외선(NIR) 레이저로 조사하면 AuNP가 상당한 열을 발생시켜 멤브레인이 파열되고 Ca2+ 이온이 유입됩니다. 결과적으로, 원형질막 복구(PMR) 기계가 활성화되며, 이는 ANXA를 손상 부위에 모집하여 음전하를 띤 인지질에 결합하는 것을 포함합니다. (비-디) ANXA2를 포함하는 세포와 ANXA4를 포함하는 GUV의 컨포칼 현미경 이미지는 이 과정을 보여줍니다. (i) 방사선 조사 전, 이미지는 방사선 조사 부위가 흰색 화살표로 표시된 온전한 세포 또는 GUV를 보여줍니다. (ii) 나노 입자 조사 시, (B) ANXA는 손상 부위에 빠르게 모집되어 막 상처 주위에 고리 모양의 구조를 형성합니다(B[ii-iv ]). 패널 (C)는 ANXA가 없는 멤브레인 염색 GUV를 보여주며, 펑크가 나면 관찰 가능한 멤브레인 리모델링 없이 빠르게 재밀봉됩니다. 반면에, 패널 (D)는 재조합 ANXA4를 함유하는 GUV를 보여주며, 이는 (i) 막을 가로지르는 Ca2+ 누출로 인한 방사선 조사 전에 이미 막에 결합되어 있습니다. (ii) 구멍이 뚫리면 ANXA4가 자유 가장자리에 결합하여 멤브레인이 가장자리에서 굴러 떨어질 때 GUV가 붕괴됩니다. 눈금 막대는 그림 (B)의 경우 10μm, B(i)의 경우 2μm, (C)의 경우 10μm, (D)의 경우 15μm입니다. 이 그림은 Moreno-Pescador 등에서 재현되었습니다. Royal Society of Chemistry의 허가를 받은 al16 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 완전한 ANXA 고리 유사 구조(그림 2B 및 보충 그림 1)의 분석은 상처 크기 및 형태에 대한 유용한 통찰력을 제공합니다. ANXA 링 구조의 반경은 섹션 5에 설명된 대로 시간과 공간에 따라 결정될 수 있습니다. Moreno et al.16은 살아있는 세포에서 135개 이상의 원형질막 손상을 분석했으며, ANXA5 고리 구조 분석은 그림 3에 나와 있습니다. 반경은 붕괴된 강도 프로파일의 전체 너비 절반 최대값을 기준으로 링의 중심에서 곡선의 외부 반경까지의 거리를 측정하여 결정되었습니다(그림 3A). 이 연구 결과는 ANXA5 고리 크기(그림 3B)의 이질적인 분포를 보여주었으며, 이는 시간(그림 3D,G,H)과 공간(그림 3C,E,F)에 따라 일정하게 유지되었습니다. 이러한 결과는 손상 부위 주변에 ANXA5가 축적되었음을 시사하며, 이는 손상된 막5의 가설된 깔때기와 같은 내부 발아에 대한 살아있는 세포에서 대안적인 ANXA5 매개 PMR 전략을 나타냅니다. 그림 3: 살아있는 세포의 손상 부위를 둘러싼 ANXA5 고리 구조 분석. (A) 개략적인 표현은 ANXA 강도 라인 프로파일의 전체 너비 절반 최대값을 기반으로 하는 분석 접근 방식을 보여줍니다. (B) 히스토그램은 측정된 135개의 ANXA5 링 반경을 보여줍니다. (C) z-스택의 각 z-섹션에 대한 ANXA5-GFP 링의 형광 강도 라인 프로파일. (D) 컨포칼 이미지는 ANXA5-GFP가 부상 직후 상처 주변에 축적된 후 상처 안정화가 이루어지는 상처의 시간 변화를 보여줍니다. 1-6으로 표시된 시간 프레임은 프레임당 0.66초 간격으로 캡처되었습니다. 눈금 막대는 2μm입니다. (E) 상처의 반경은 패널 A에 제시된 방법에 따라 상처 깊이의 함수로 결정되었습니다. (F) 상처의 기울기는 패널 E에서 추출한 데이터를 기반으로 z-높이의 함수로 ANXA5 고리 반경으로 분석되었습니다. (G) 형광 강도 라인 프로파일은 패널 D의 ANXA5-GFP 링에서 측정되었습니다. 여기서 각 시간 간격 1-6은 슬라이스 1-6으로 표시됩니다. 마지막으로, (H) ANXA5-GFP 링 반경의 시간 변화는 패널 G의 데이터에서 계산된 시간의 함수로 표시됩니다. 이 그림은 Moreno-Pescador 등에서 재현되었습니다. Royal Society of Chemistry의 허가를 받은 al16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. PM을 단독으로 교란하여 형성된 고리 모양의 구조(보충 그림 1)와 비교하여, 핵에 근접한 손상(보충 그림 2A)은 상처의 진화 및 기하학적 구조에 영향을 미칠 수 있습니다. 간혹 ANXA 링의 일부만 명백한 경우가 있었는데(보충 그림 2B,C), 추가 데이터가 손실될 수 있지만 사내 MATLAB 분석 워크플로(섹션 5 참조)를 사용하여 분석할 수도 있습니다. 전형적으로, 비부착성 세포에서 관찰되는 ANXA 고리 형성(보충 그림 2C)은 핵과 세포 주변 모두에 가깝게 위치합니다. 결과적으로, 더 길쭉한 고리 구조가 관찰될 수 있으며, 이는 제시된 데이터 분석에 최적이 아닙니다. 또한, 비부착 세포는 PM 손상 후 세포 사멸에 더 취약한 것으로 나타났습니다. 또한 AuNP 응집체의 방사선 조사로 인한 부상을 고려할 때 이러한 부상이 더 심각하고 통제하기 어려울 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이는 플라즈몬 가열이 크게 증가하여 셀의 상당 부분을 손상시킬 수 있기 때문입니다. 결과적으로 이러한 부상은 ANXA5 링 분석에 포함되지 않았습니다. 또한, 예비 발견은 열 플라즈모닉스를 사용한 원형질막의 파괴가 세포 내 Ca2+ 수준을 상승시킨다는 것을 나타냅니다. 이는 단일 AuNP의 저강도 조사에서도 관찰되었으며, 이는 그림 4에 표시된 바와 같이 PM 투과화35를 시사합니다. Ca2+ 유입은 막 결합 칼슘 프로브인 GCaMP6s-CAAX를 발현하는 세포에서 관찰되었으며, 이는 Ca2+ 유입 시 구조적 변화를 겪으며, 따라서 그 강도의 증가를 관찰할 수 있습니다64. 칼슘 강도는 시간 경과에 따라 세포의 전체 발자국에 대해 정량화되었습니다. 배경 소음을 제거하기 위해 멤브레인 파괴 및 멤브레인 수리 후 전에 배경 Ca2+ 수준을 뺐습니다. 최대 강도는 세포 내의 평균 Ca2+ 강도를 정규화하여 결정되었으며, 그 결과 그림 4B에 표시된 바와 같이 급격한 초기 Ca2+ 강도 증가 후 느린 감소를 나타내는 강도 곡선이 생성되었습니다. 세포는 ~ 6.6 s에서 최대 칼슘 강도에 도달했으며, 이는 칼슘 강도 피크 시간 (t= tc)이 상처 봉합에 필요한 시간에 해당한다고 제안한 Klenow et al.64의 발견과 일치합니다. 그럼에도 불구하고, 막 복구 및 상처 치유의 근본적인 메커니즘을 확립하기 위해서는 추가 조사가 필요하지만, 예비 연구 결과에 따르면 이 Ca2+ 과정은 양성 대조군으로 사용된 손상되지 않은 세포가 아닌 손상된 세포에서만 관찰되었습니다. 이는 세포내 칼슘 수준이 더 이상 Ca2+ 유입과 경쟁하지 않기 때문에 성공적인 PMR 후 과잉 세포 내 칼슘이 활발하게 펌핑되는 열플라즈모닉막 파괴 시 세포가 Ca2+ 유입을 경험했음을 확인시켜주며, 결국 세포 항상성64를 달성합니다. 그림 4: 칼슘 유입은 HEK293T 세포의 원형질막이 열플라즈모닉스에 의해 파열될 때 발생합니다. 일련의 컨포칼 이미지는 멤브레인 결합 칼슘 프로브인 GCaMP6s-CAAX를 발현하는 두 개의 세포(관심 세포와 양성 대조군으로 사용되는 손상되지 않은 세포)를 보여줍니다. 눈금 막대의 크기는 10μm입니다. (A) 조사 전인 00:00초에 두 세포의 발자국이 회색 점선으로 시각화되고 조사 부위가 노란색 원으로 표시됩니다. 레이저 조사 시, Ca2+ 의 급격한 유입이 관찰되어 ~ 6.6 초에서 최대 강도에 도달하며, 이는 주황색 점선으로 표시되며, 이는 상처 봉합 시간(64)에 해당하는 것으로 추정되는 시점입니다. (B) 손상된 세포(파란색 선)의 GCaMP6s-CAAX 프로브에서 얻은 칼슘 강도 프로파일을 인접한 손상되지 않은 세포(회색 점선)의 Ca2+ 강도와 비교하여 PM 붕괴 시에만 명확한 Ca2+ 유입을 보여주었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 연구는 막 파괴 후 살아있는 세포 및 모델 막에서 단백질 반응을 탐색하기 위한 유망한 기술로서 열플라즈몬 접근 방식을 강조합니다. 이 방법은 단백질 모집에 대한 광범위한 정보뿐만 아니라 단백질-막 역학에 관여하는 단백질의 생물물리학적 기능에 대한 정보도 제공합니다. 결과적으로, 표면 수리를 담당하는 분자 성분의 식별을 용이하게 하고 원형질막 수리의 복잡하지만 중요한 기계에 대한 이해를 증진합니다. 기계적, 화학적, 광학적 기법 등 막파괴를 유도하는 다양한 방법이 존재하지만, 이러한 방법은 세포에 특이적이지 않거나, 세포막에 다발성 손상을 일으키거나, 막에 심각한 손상을 일으키거나, 고출력 펄스 레이저를 사용할 때 레이저 경로를 따라 내부 세포 물질을 절제하는 등의 한계가 있습니다. 컨포칼 현미경과 광학 핀셋의 통합이 가장 포괄적인 정보를 제공하지만, 대체 이미징 방식도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 플라즈몬 나노입자의 이미징은 반사 현미경을 사용하여 이루어지기 때문에 라이카 컨포칼 현미경에 내장된 이미징 모드, 암시야 현미경 ^65,66, iSCAT ^67,68과 같은 기타 산란 방법 또는 나노 입자의 형광 표지와 같은 추가 이미징 기술을 AuNP 시각화에 사용할 수 있지만 이는 방법의 적용 가능성을 제한할 수 있습니다.

제시된 방법은 모델 멤브레인에 나노 정공을 유도할 수 있어 서로 다른 부속서 간의 시너지 효과를 조사할 수 있습니다. 이는 서로 다르게 표지된 재조합 부속서(예: RFP 및 GFP)를 각각 캡슐화한 후 열플라즈몬 천공을 수행하여 달성됩니다. 이 모델 시스템은 그림 2D에서 볼 수 있듯이 부속서가 자유 가장자리 근처의 멤브레인과 어떻게 상호 작용하는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나 세포와 달리 GUV에 가해진 구멍은 계속 확장되고 소포가 불안정해집니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 홀 진화를 이미징하는 것은 홀 직경의 급격한 확장으로 인해 어려울 수 있지만 시간이 지남에 따라 여러 z-stack을 캡처하여 수행할 수 있습니다. 또 다른 방법은 더 빠른 이미징을 위해 회전 디스크 공초점 렌즈를 사용하는 것입니다. 또한, 열플라즈몬 접근법은 일반적으로 20°C에서 30°C 사이의 시료 온도에서 단일 셀 또는 GUV 실험(보통 2-3개)에 적용할 때 시간당 제한된 수의 최적의 결과를 산출합니다. 단백질-막 역학을 가장 정확하게 관찰하려면 세포를 HEPES 함유 완충액에 보관하고 매시간 샘플을 교체하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 실험 창은 세포 배양 챔버, 즉 5 % CO₂ 로 37 °C의 일정한 온도에서 실험을 수행함으로써 연장 될 수 있습니다. 또한 이 접근 방식을 확률적 광학 재구성 현미경(STORM)과 같은 다른 이미징 기술과 결합하면 단일 분자 수준에서 막 복구에 관여하는 주요 단백질의 생물물리학적 기능 및 상호 작용에 대한 더 깊은 이해를 제공할 수 있습니다. 이를 통해 상처 형상 및 부속 단백질의 위치를 포함하여 부상 부위에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 막 표면 복구와 관련된 다른 주요 요인을 식별할 수 있습니다.

멤브레인 손상을 유도하는 데 있어 최대의 효과와 정밀도를 달성하려면 각 실험 전에 레이저 초점의 위치를 확인하고 레이저 초점의 축 위치가 공초점 초점과 일치하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 정렬은 AuNP 이미징 중 강도를 최적화하여 더 낮은 레이저 출력에서 최대 국부 온도 상승과 그에 따른 멤브레인 손상을 초래합니다. 이 공정은 수동으로 실행되므로 초점이 입자의 위치와 일치하는 위치로 수동으로 변환되기 때문에 막 파열 효율의 변동성에 취약합니다. 일부 상용 시스템에서와 같이 반사 모드가 없는 현미경에서는 레이저 초점과 입자의 공동 위치 파악이 어려울 수 있습니다. 이러한 경우 대체 이미징 모드(예: 명시야)를 사용할 수 있으며 예상되는 입자 위치 주변에서 느린 래스터 스캔을 수행할 수 있습니다. 낮은 레이저 출력은 멤브레인 투과성만 유도할 가능성이 높은 반면, 높은 레이저 출력은 유리 표면에 냉각 효과가 있더라도 물의 끓는점을 초과하는 NP 주변의 온도를 생성할 수 있습니다. NPs를 포위하는 nanobubbles의 대형은 폭발성 열이 레이저 초점에서 입자 치환 또는 입자 파편화 귀착될지도 모르다²⁰⁰ °C와 300 °C ^25,48 사이에서 일어난다는 것을 추정됩니다. 게다가, 가열 도중 nano microbubbles의 대형은 이 방법에 도전을 제기합니다. 공기 계면은 멤브레인을 적시고 단백질 불안정화를 유발할 수 있으며, 이는 바람직하지 않으므로 멤브레인 복구를 조사할 때 가열을 제한하는 것이 필수적입니다. 특히, 금 나노 쉘은 고온을 견디지 못하며 고해상도 현미경⁽⁵⁸)에 의해 입증 된 바와 같이 이러한 조건에서 분해됩니다.

이 기사에서는 열플라즈모닉스를 사용하여 세포막과 모델 막 모두에 적용할 수 있는 막의 고도로 국소화된 천공을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 가열 범위를 더욱 줄이기 위해 NIR 빛과 공명하는 더 작은 나노 입자를 사용하여 엔도솜, 소포체 및 핵 외피의 세포 내 천공을 가능하게 할 수 있습니다. 간상 및 나노마트료시카(⁴⁸)를 포함하는 이러한 나노입자는 세포 표면에서 쉽게 흡수되어 핵(⁶⁹)을 향하여 교통되는 세포내이입된 금 나노입자를 표적으로 하여 핵외피 복구를 조사하는데 사용될 수 있다. 전반적으로, 이 기술은 PMR과 관련된 주요 분자 성분의 식별 및 검사를 가능하게 하여 세포의 생존력을 보존하면서 생물물리학적 기능과 역할을 규명합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

재조합 아넥신 단백질과 아넥신을 인코딩하는 플라스미드를 제공해주신 Jesper Nylandsted에게 감사드립니다. 이 연구는 덴마크 독립 연구 자연 과학 위원회(DFF-4181-00196), 노보 노디스크 재단 학제 간 시너지 프로그램 2018(NNF18OC0034936), 덴마크 암 학회 과학 위원회(R90-A5847-14-S2), 룬드벡 재단(R218-2016-534) 및 룬드벡 재단 우수 센터(나노의학 생체막)의 재정 지원을 받았습니다.

Materials

1064 nm trapping laser	Spectra Physics	N/A	Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold Nanoshells	NanoComposix	NCXGSIR150
200 nm Gold Nanoparticles	BBI Solutions	EM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwell	MATTEK	P35G-1.5-14-C
Amber-glass vials	Supelco Sigma Aldrich	243438
Annexin A2 plasmids	N/A	N/A	Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein	N/A	N/A	N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein	N/A	N/A	N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-casein	Sigma Life Science	C6905-1G
CaCl₂	Suprlco (sigma Aldrich)	10035-04-8
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702
Chloroform	VWR Chemicals	67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface)	Thermo scientific	150460
DID cell-labelling Solution	Invitrogen	7757
Distilled water	Gibco	15230-089
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C	Dissolved in chloroform
DOPS	Avanti Polar Lipids	840035C	Dissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's Medium	Thermo Fisher Scientific	11995065
FIJI ImageJ distribution	ImageJ2	N/A
GCaMP6s-CAAX		N/A	Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	11573397	10% of the culture medium
Glucose	PROLABO	24 374.297
Hamilton syringes	Hamilton Company	N/A	50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002	Harrick Plasma	N/A
HEK293T cells		N/A	Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS)	Leica	N/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2	Leica	N/A
Leica SP5 confocal scanning microscope	Leica	N/A
Lipofectamine	Fisher Scientific	15338030
MatLab	The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States	N/A
NaCl	VWR Chemicals	7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	11058021
Parafilm	Bemis	PM-992
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	1% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20)	Physik Instrumente (Germany)	N/A
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920-100ML	0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcohol	Sigma-Aldrich	363065-25G
round glass slide 25 mm Ø	VWR	631-1584
Sonicator Brandson 2800	Brandson	N/A
sucrose	Sigma Life Science	57-50-1
T25 tissue culture flask	Falcon	353108	Blue Vented cap
Tris-HCl	Invitrogen	15567-027
TrypLE	Thermo Fisher Scientific	A1285901
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	11590626
VWR Mixer mini vortex 230V EU	VWR	12620-84	ECN: 444-2790, SN: 150713022

References

Bendix, P. M., et al. Interdisciplinary synergy to reveal mechanisms of annexin-mediated plasma membrane shaping and repair. Cells. 9 (4), 1029 (2020).
Gajic, O., Lee, J., Doerr, C. H., Berrios, J. C., Myers, J. L., Hubmayr, R. D. Ventilator-induced Cell Wounding and Repair in the Intact Lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 1057-1063 (2003).
McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. The American Journal of Pathology. 140 (5), 1097-1109 (1992).
Yu, Q. C., McNeil, P. L. Transient disruptions of aortic endothelial cell plasma membranes. The American Journal of Pathology. 141 (6), 1349-1360 (1992).
Boye, T. L., et al. Annexin A4 and A6 induce membrane curvature and constriction during cell membrane repair. Nature Communications. 8, 1623 (2017).
Bischofberger, M., Gonzalez, M. R., van der Goot, F. G. Membrane injury by pore-forming proteins. Current Opinion in Cell Biology. 21, 589-595 (2009).
Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells. Science (New York, N.Y.). 356, 1022-1025 (2017).
Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair: Dealing with life’s little traumas. Bioarchitecture. 1, 114-121 (2011).
Sønder, S. L., et al. Annexin A7 is required for ESCRT III-mediated plasma membrane repair. Scientific Reports. 9, 6726 (2019).
Andrews, N. W., Almeida, P. E., Corrotte, M. Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 24 (12), 734-742 (2014).
Idone, V., Tam, C., Goss, J. W., Toomre, D., Pypaert, M., Andrews, N. W. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. The Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
Lauritzen, S. P., Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins are instrumental for efficient plasma membrane repair in cancer cells. Seminars in Cell & Developmental Biology. 45, 32-38 (2015).
Häger, S. C., Nylandsted, J. Annexins: players of single cell wound healing and regeneration. Communicative & Integrative Biology. 12 (1), 162-165 (2019).
Jaiswal, J. K., et al. S100A11 is required for efficient plasma membrane repair and survival of invasive cancer cells. Nature Communications. 5, 3795 (2014).
Draeger, A., Monastyrskaya, K., Babiychuk, E. B. Plasma membrane repair and cellular damage control: The annexin survival kit. Biochemical Pharmacology. 81 (6), 703-712 (2011).
Moreno-Pescador, G. S., et al. Thermoplasmonic nano-rupture of cells reveals annexin V function in plasma membrane repair. Nanoscale. 14 (21), 7778-7787 (2022).
Zhivotovsky, B., Orrenius, S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective from the cell death community. Cell Calcium. 50 (3), 211-221 (2011).
Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: From structure to function. Physiological Reviews. 82 (2), 331-371 (2002).
Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. Two-way traffic on the road to plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 18 (11), 552-559 (2008).
Boye, T. L., et al. Annexins induce curvature on free-edge membranes displaying distinct morphologies. Scientific Reports. 8, 10309 (2018).
Bouter, A., et al. Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair. Nature Communications. 2, 270 (2011).
Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins in plasma membrane repair. Biological Chemistry. 397 (10), 961-969 (2016).
Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
Numata, T., Tatsuta, H., Morita, Y., Otani, Y., Umeda, N. Localized thermal processing with a laser-trapped and heated metal nanoparticle. IEEJ Transactions on Electrical and Electronic Engineering. 2, 398-401 (2007).
Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
Kyrsting, A., Bendix, P. M., Stamou, D. G., Oddershede, L. B. Heat profiling of three-dimensionally optically trapped gold nanoparticles using vesicle cargo release. Nano Letters. 11 (2), 888-892 (2011).
Andersen, T., Kyrsting, A., Bendix, P. M. Local and transient permeation events are associated with local melting of giant liposomes. Soft Matter. 10 (24), 4268-4274 (2014).
Bahadori, A., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Hot-nanoparticle-mediated fusion of selected cells. Nano Research. 10, 2034-2045 (2017).
Rørvig-Lund, A., Bahadori, A., Semsey, S., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Vesicle fusion triggered by optically heated gold nanoparticles. Nano Letters. 15 (6), 4183-4188 (2015).
Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Ruhoff, V. T., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic vesicle fusion reveals membrane phase segregation of influenza spike proteins. Nano Letters. 23 (8), 3377-3384 (2023).
Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. SPIE Proceedings. SPIE 9922, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 992211, (2016).
Bahadori, A., Moreno-Pescador, G., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Remotely controlled fusion of selected vesicles and living cells: a key issue review. Reports on Progress in Physics. 81 (3), 32602 (2018).
Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic induced vesicle fusion for investigating membrane protein phase affinity. bioRxiv. , (2022).
Pescador, G. S. M., et al. Investigating plasma-membrane repair employing thermoplasmonics. Biophysical Journal. 120 (3), 45A (2021).
Moreno-Pescador, G. S., Qoqaj, I., Thusgaard Ruhoff, V., Iversen, J., Nylandsted, J., Bendix, P. M. Effect of local thermoplasmonic heating on biological membranes. SPIE 11083, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XVI. 110830M, (2019).
Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current Biology. 9 (11), 579-587 (1999).
Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 4 (139), 139ra85 (2012).
Sudji, I. R., Subburaj, Y., Frenkel, N., García-Sáez, A. J., Wink, M. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 20 (11), 20146-20160 (2015).
Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Intracellular Ca2+ operates a switch between repair and lysis of streptolysin O-perforated cells. Cell Death & Differentiation. 16, 1126-1134 (2009).
Nygård Skalman, L., Holst, M. R., Larsson, E., Lundmark, R. Plasma membrane damage caused by listeriolysin O is not repaired through endocytosis of the membrane pore. Biology Open. 7 (10), bio035287 (2018).
Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6004-6009 (2014).
Yeheskely-Hayon, D., Minai, L., Golan, L., Dann, E. J., Yelin, D. Optically induced cell fusion using bispecific nanoparticles. Small. 9 (22), 3771-3777 (2013).
Minai, L., Yeheskely-Hayon, D., Golan, L., Bisker, G., Dann, E. J., Yelin, D. Optical nanomanipulations of malignant cells: Controlled cell damage and fusion. Small. 8 (11), 1732-1739 (2012).
Lukianova-Hleb, E., et al. Plasmonic nanobubbles as transient vapor nanobubbles generated around plasmonic nanoparticles. ACS Nano. 4 (4), 2109-2123 (2010).
Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81, 1015-1047 (2005).
Baffou, G., Polleux, J., Rigneault, H., Monneret, S. Super-heating and micro-bubble generation around plasmonic nanoparticles under cw illumination. Journal of Physical Chemistry C. 118 (9), 4890-4898 (2014).
Sasikumar, K., Liang, Z., Cahill, D. G., Keblinski, P. Curvature induced phase stability of an intensely heated liquid. Journal of Chemical Physics. 140 (23), 234506 (2014).
Jauffred, L., Samadi, A., Klingberg, H., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Plasmonic heating of nanostructures. Chemical Reviews. 119 (13), 8087-8130 (2019).
Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
Bendix, P. M., Jauffred, L., Norregaard, K., Oddershede, L. B. Optical trapping of nanoparticles and quantum dots. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 20, 15-26 (2014).
Samadi, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Optical manipulation of individual strongly absorbing platinum nanoparticles. Nanoscale. 46, 18449-18455 (2017).
Jørgensen, J. T., Norregaard, K., Tian, P., Bendix, P. M., Kjaer, A., Oddershede, L. B. Single particle and PET-based platform for identifying optimal plasmonic nano-heaters for photothermal cancer therapy. Scientific Reports. 6, 30076 (2016).
Goldenberg, H., Tranter, C. J. Heat flow in an infinite medium heated by a sphere. British Journal of Applied Physics. 3 (9), 296-298 (1952).
Eustis, S., El-Sayed, M. A. Why gold nanoparticles are more precious than pretty gold: Noble metal surface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Society Reviews. 35, 209-217 (2006).
Landau, L. D., Lifshitz, E. M. . Fluid Mechanics: Landau and Lifshitz: Course of Theoretical Physics. 6, (2013).
Niederauer, C., Seynen, M., Zomerdijk, J., Kamp, M., Ganzinger, K. A. The K2: Open-source simultaneous triple-color TIRF microscope for live-cell and single-molecule imaging. HardwareX. 13, e00404 (2023).
Richardson, A. C., Reihani, N., Oddershede, L. B. Combining confocal microscopy with precise force-scope optical tweezers. SPIE Proceedings:SPIE 6326, Optical Trapping and Optical Micromanipulation III. 632628, (2006).
Samadi, A., Klingberg, H., Jauffred, L., Kjær, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Platinum nanoparticles: a non-toxic, effective and thermally stable alternative plasmonic material for cancer therapy and bioengineering. Nanoscale. 10 (19), 9097-9107 (2018).
. Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A7816 (2023)
Kreibig, U., Vollmer, M. Theoretical considerations. In: Optical Properties of Metal Clusters. 25, (1995).
Mie, G. Beiträge zur Optik trüber Medien, speziell kolloidaler Metallösungen. Annalen der Physik. 330 (3), 377-445 (1908).
Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
Klenow, M. B., Heitmann, A. S. B., Nylandsted, J., Simonsen, A. C. Timescale of hole closure during plasma membrane repair estimated by calcium imaging and numerical modeling. Scientific Reports. 11, 4226 (2021).
Li, T., Wu, X., Liu, F., Li, N. Analytical methods based on the light-scattering of plasmonic nanoparticles at the single particle level with dark-field microscopy imaging. Analyst. 142 (2), 248-256 (2017).
Gibbs-Flournoy, E. A., Bromberg, P. A., Hofer, T. P. J., Samet, J. M., Zucker, R. M. Darkfield-Confocal Microscopy detection of nanoscale particle internalization by human lung cells. Particle and Fibre Toxicology. 8 (1), 2 (2011).
Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering microscopy: Seeing single nanoparticles and molecules via Rayleigh scattering. Nano Letters. 19 (8), 4827-4835 (2019).
Wu, Y., Ali, M. R. K., Chen, K., Fang, N., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles in biological optical imaging. Nano Today. 24, 120-140 (2019).
Klingberg, H., Oddershede, L. B., Loeschner, K., Larsen, E. H., Loft, S., Møller, P. Uptake of gold nanoparticles in primary human endothelial cells. Toxicology Research. 4 (3), 566-666 (2015).

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Danielsen, H. M. D., Arastoo, M. R., Moreno-Pescador, G., Bendix, P. M. A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes. J. Vis. Exp. (203), e65776, doi:10.3791/65776 (2024).