生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

1. 細胞膜穿刺の準備 細胞播種(1日目)ヒト胚性腎臓(HEK293T)細胞を培地中で、5%CO2 加湿器インキュベーターで37°Cの培養液中で、70%のコンフルエントに達するまで培養します。 500 μLのトリプシンを使用して細胞を表面から剥離し、200,000 HEK293T細胞をカウントし、総容量3 mLの培地を入れた培養皿に播種します。細胞を37°Cの5%CO2 加湿器インキュベーターで24時間インキュベートします。注:ディッシュの中心での細胞のクラスタリングを防ぐには、トランスフェクション効率を低下させる可能性があるため、細胞を均等に広げ、ディッシュを渦巻かせないようにしてください。 細胞トランスフェクション(2日目)注:トランスフェクションした細胞は、トランスフェクション後48時間まで使用できます。使用前に、目的のプラスミドとトランスフェクション試薬を5秒間ピペットでつなぎます。 滅菌済み 2 mL チューブ中で、500 μL の還元血清培地、5 μL のトランスフェクション試薬(プラスミドの 4 倍)、プラスミド 1.25 μL(1 μg/μL)を特定の順序で混合します。注:膜破裂時のカルシウム流入を調べるには、同じ手順に従いますが、膜結合型カルシウムセンサープローブGCaMP6-CAAX(1 μg/μL)を使用します。 トランスフェクション混合物を静かに、しかし完全にピペッティングし、室温(RT)で30分間インキュベートしてから、細胞に滴下します。 トランスフェクション混合物を添加する前に、培地を培養皿から取り出し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を静かに洗浄し、2000 μLの還元血清培地を皿に加えます。 5% CO2 加湿器インキュベーター中で37°Cのトランスフェクション混合物とともに細胞を2時間45分間インキュベートしてから、培地を3 mLの培地に交換します。 金ナノ粒子(AuNP)溶液の調製(2日目)200 nm AuNP ストック溶液をレベル 10 で 10 秒間ボルテックスし(装置の詳細な仕様については 、材料表 を参照)、5 分間超音波処理し(最大振幅)、再度 10 秒間ボルテックスします。 150 μL の AuNP と 850 μL の蒸留水を混合して、総量 1 mL にします。注:希釈したAuNP溶液は冷蔵庫で保存し、最大1か月間再利用できます。 実験皿の準備(2日目)マイクロウェルディッシュを150 μLの0.01%-0.1%細胞接着溶液でコーティングし、室温で15分間インキュベートします。 ガラス表面を500μLの蒸留水で2回洗浄し、~10分間風乾させます。 80 μLのAuNP溶液を乾燥表面に滴下します。注:AuNP凝集物を最小限に抑えるために、希釈したAuNP溶液をコーティングされたガラス表面に添加する前に、ボルテックス(10秒)、超音波処理(5分)、およびボルテックス(10秒)します。 ~10分待ってから、1.5 mLの培地を導入します。皿を37°Cで一晩インキュベートします。 実験室の準備(3日目)注:実験チャンバーは、3日目または4日目のいずれかに準備できます。ただし、以下の準備は実験当日に行うようにしてください。培養皿内の細胞から培地を取り出し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。注意: この手順は、後続の手順を妨げる可能性のある残留媒体や破片を取り除くために不可欠です。 500 μLの酵素ベースの細胞剥離溶液をウェルに加え、細胞が培養皿から剥離するまで1〜3分間インキュベートします。 1.5 mLの新鮮な培地を加え、細胞溶液をピペットで移して均質な細胞溶液を得ることで、細胞クラスターの可能性を最小限に抑えます。 実験用マイクロウェルのAuNPから培地を慎重に除去します。 細胞溶液(2 mL)をマイクロウェルに加え、実験を行う前に少なくとも5時間インキュベートします。注:最適な実験条件を得るには、チャンバーの中央に細胞が集まる可能性があるため、チャンバーを旋回させないでください。 2. 細胞膜穿刺実験 実験の光学的設定共焦点走査型顕微鏡と1064nmのトラッピングレーザー57を組み合わせて実験を行う。 開口数(NA)1.2の63倍の水浸対物レンズを使用して、焦点面での光学トラッピングを実行します。 焦点がエアリーディスクのサイズであり、照射レーザーの焦点ビーム幅が半径が~540nmであると仮定します。 面積あたりのレーザー出力(W / cm2)を計算して、レーザー出力(P)を対応するレーザー強度(I)に変換します。 光電子増倍管で検出した複数の蛍光シグナルと、散乱シグナルによる金属NPの同時検出を、音響光ビームスプリッター(AOBS)を用いて可視化します。注:すべての共焦点システムに、金属NPの反射イメージングを可能にするAOBSが装備されているわけではありません。ここでは、他の形式の検出を実装するか、セルの下の領域でNIRレーザーの連続スキャンを試みることができます。 実験セッション中は、細胞、分子蛍光プローブ、および金ナノ粒子を含むガラス底のオープンチャンバーを顕微鏡に取り付けます。 圧電ステージに取り付けられたサンプルを並進させることにより、細胞に対してトラップを移動させ、ナノメートル精度の横方向の動きを可能にします16。注意: オプティカルトラップは静止したままです。 細胞膜穿刺の実験設定アネキシンプラスミドと蛍光タンパク質を結合させたHEK293T細胞を、ガラス表面に固定化された単離されたAuNPの上に置きます(図1A)。 GFP蛍光シグナルの可視化にはアルゴン488nmレーザーを、走査型共焦点顕微鏡でのAuNP反射の観察にはHeNe 633nmレーザーを使用します。 1064 nmの近赤外レーザーで動作する光ピンセットを使用して、単一のAuNPを~1秒間照射し、原形質膜を破壊する大幅な局所的な温度上昇を誘発します。 集光した粒子に200〜295mWの照射を施すと、実質的に温度が上昇します。注意: 光学系内では電力が大幅に低下し、焦点でのレーザー出力は、特定の設定に応じて、記載されているミリワットの約20%に達します。比強度(W/cm2で測定)は、システムの正確なアライメント、特に焦点サイズによって異なります。さらに、ガラスの熱伝導はセルや水の熱伝導よりも高いため、原形質膜に放出される熱量がわずかに減少します48,58。 近赤外レーザーの焦点スポットの局在を適切に校正することにより、効果的で局所的なPM損傷とその後のタンパク質修復応答を達成します。これは、同じイメージング媒体に懸濁した単一のAuNPを捕捉し、照射前に選択したAuNPに焦点が合っていることを確認することによって達成されます。注:ナノ粒子は、共焦点顕微鏡で観察した場合に、その散乱信号が最も鋭く見える場合、つまり、粒子の周囲に明確なエッジとハローがない場合に焦点が合っていると見なされます(図2C(ii))。 細胞とAuNPの密度条件細胞膜の重なりを防ぐために、細胞クラスターではなく単一細胞を選択します。注:細胞は表面に接着し、平坦な形態(補足図1)を示し、核膜の損傷を防ぎながら細胞周辺に穴を開けることができます(補足図2)。 プロトコルに従って、または細胞が沈殿して平らになるまで細胞をインキュベートし、AuNP細胞の取り込みを防ぎます。過度のインキュベーション時間を避け、PEG化AuNPを使用してAuNPエンドサイトーシスの可能性を低減します。 固定化されたAuNPが単一の粒子として存在し、凝集を防ぐために互いに十分な間隔を空けて存在することを確認します。凝集体は温度勾配の大幅な増加につながり、その結果、温度が上昇し、細胞のかなりの部分が破壊される可能性があります。 細胞の健康を維持するために、1〜2時間ごとにサンプルを交換してください。注:長時間の曝露は細胞の健康状態の悪化につながり、膜修復の観点から損傷に正確に反応する能力を損なう可能性があります。この細胞の健康状態の低下は、通常、細胞がより球状で硬く見えるため、細胞の形状の変化によって観察され、最終的には細胞死に達します。 補足情報。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3. 巨大単層小胞(GUV)の調製 脂質混合物の調製1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)と1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)脂質を4:1のモル比で組み合わせてGUV脂質組成物を作成します( 表1を参照)。実験の必要性に応じて脂質ストックを1.5 mLガラスバイアルに分注し、-20°Cで保存します。注:脂質を長期間保存し、不飽和脂質の酸化を防ぐために、分注されたバイアル内の空気をアルゴンと交換してください。 脂質を混合する前に、50 μLおよび500 μLのガラスまたは金属シリンジをクロロホルムで5回完全に洗浄し、クロロホルムに溶解した脂質の汚染物質がないことを確認します。注意: クロロホルムは毒性があるため、ドラフト内で取り扱ってください。計算された量のクロロホルムを清潔な琥珀色のガラスバイアルに移し、続いて指定された量の各脂質を移します( 表1を参照)。注:脂質ストック間のクロスコンタミネーションを避けるため、シリンジは必ずクロロホルムで洗浄してください。 最後に、メンブレン色素を添加し、ピペッティングで脂質を完全に混合します。調製した脂質混合物を-20°Cで保存し、さらに使用してください。混合物は、かなりの脂質損傷なしに2〜3週間生存可能です。注意: 混合は、金属またはガラスのシリンジで行う必要があります。脂質が冷凍庫から出るときは、常に氷の上に保管してください。 ポリビニルアルコール(PVA)ゲルの調製Weinberger et al.23によって記述されたゲルアシスト水和法を使用して、わずかな変更を加えて GUV を調製します。50 mM スクロース、25 mM NaCl、25 mM Tris(pH 7.4)を含むバッファー100 mLにPVA5 gを溶解して、PVAゲルを調製します。 PVA溶液を85°Cに加熱し、透明になるまで攪拌します。RTまで冷まし、冷蔵庫に保管してさらに使用してください。注:PVAは緩衝液に適切に溶解していないため、85°Cまで加熱する必要があります。 スライドガラスの作製スライドガラスをエタノールで洗浄し、風乾させます。次に、スライドをエアプラズマクリーナーで処理して、ガラス表面に残っている汚染を取り除きます。 PVAコーティングされたスライドガラスの作製PVAゲル(5%)を60°Cで30分間温めると、流動性が高まります。90 μLの温かいPVAをスライドガラスに塗布し、均一に広げ、50°Cの加熱キャビネットで50分間乾燥させます。 PVAスライドガラスの準備ができたら、ガラスまたは金属のシリンジを使用して調製した脂質混合物30 μLを加え、針の端を使用して薄膜に広げます。 穏やかな窒素圧力下でクロロホルム含有量を蒸発させて、脂質混合物を乾燥させます。さらに、スライドガラスを真空下で1.5〜2時間乾燥させます。 チャンバー内でのGUVの栽培以前に公開されたレポート59と同様の設計の社内チャンバーを、準備したスライドガラスを使用して組み立てます。 別の 2 mL チューブで、目的の組換えタンパク質(この場合は ANXA5 または ANXA4)を、80 mM スクロース、70 mM NaCl、および 25 mM Tris-HCl(pH 7.4)からなる増殖バッファー(GB)で最終濃度 500 nM に希釈します。 希釈した組換えタンパク質溶液400 μLをチャンバーに加えます。チャンバーを室温で1時間インキュベートし、堆積した脂質コートからGUVを増殖させます。タンパク質を除いた同じバッファーをネガティブコントロールとして使用します。注:バッファーの蒸発を防ぐために、チャンバーをポリオレフィンフィルムで包んでください。 チャンバー内容物 400 μL を 2 mL チューブに移して GUV を回収します。 採取した溶液に 55 mM グルコース、70 mM NaCl、50 mM Tris-HCl(pH 7.4)を含む観察バッファー(OB)1 mL を添加して、GUV の外側にカプセル化されていないタンパク質を除去します。次に、溶液を600 x g で13°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離後、上清1 mLを等量の観察バッファーと交換します。GUVを穏やかなピペッティングで分散させ、GUV実験で使用するまで冷蔵庫で保管してください。 4. GUV穿刺実験 チャンバーの準備実験には35mmのガラス底のディッシュを使用します。GUVが表面に付着して破裂するのを防ぐために、表面にβ-カゼイン(5 mg / mL)を15〜30分間コーティングします。β-カゼイン溶液の場合、タンパク質 0.1 g を 20 mM Tris(PH 7.5)および 100 mM NaCl の 20 mL バッファーに溶解します。タンパク質溶液をろ過し、小さなバイアルに分注し、さらに使用するために凍結します。 チャンバーを観察バッファーで2回洗浄し、表面に余分な遊離βカゼインを除去し、室温で乾燥させます。 別の2 mLチューブで、採取したGUVをOBと混合し、CaCl2 を所望の最終濃度(この場合は200 μM)になるように混合物に添加します。 150 nmの金ナノシェル(AuN)を1:100の比率で混合物に導入します。最終混合物は、250 μL の GUV、225 μL の OB、20 μL の CaCl2 (5 mM)、および 5 μL の指定された AuN で構成されます。 実験装置混合物をチャンバーに移し、顕微鏡ステージに取り付けます。チャンバーのサイズに応じて、混合物全体または混合物の一部を追加します。注:カルシウムイオンはメンブレンを通過し、メンブレンの内部リーフレットへのアネキシンの結合を媒介するため、タイミングが重要です。 細胞穿刺実験に使用したのと同じ光学セットアップを採用します。 光ピンセットを使用して、~125 mWのレーザー出力を印加することにより、GUVに近接またはGUVの表面に個々のAuNSを捕捉します。 続いて、レーザー出力を~300mWに増やします。これにより、非常に局所的な温度上昇が発生し、標的部位のメンブレンが破壊されて穴が開けられます。注:AuNSは、固体AuNPと比較してサイズを小さく保ちながら、より高い過渡温度上昇を生成することができるため、GUV実験に適しています。 表1:GUV組成を決定するための表。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 5. 細胞穿刺実験におけるANXA応答の測定とデータ解析 MATLAB を使用してイメージを解析し、Mie の式60、61 に基づいて AuNP 温度プロファイル (図 1D、E) を計算してプロットします。 さらに、FIJI ImageJ分布62,63を使用してすべての共焦点画像を処理します。 ANXAリング半径の計算膜損傷分析の前に、生データから穿刺領域を含む関心領域を切り取ります。 ANXAリングの中心とその外周を手動でマークすることにより、各画像を処理するための社内MATLABワークフローを採用します。これらのマーキングを使用して、関心領域の処理制限を設定します。注:その後、領域は設定された制限内で放射状に処理され、中心から特定の距離での蛍光強度は、同じ中心距離で全円の平均になります。この番号は、半径ステップごとに格納されます。 このワークフローを使用して、スキャン範囲全体にわたって平均化された強度を1次元ガウス曲線に当てはめ、図3Aに示すように、RextとRintにそれぞれ対応する最大値(R、p)と半値全幅(FWHM)を特定します。 最後に、ANXA リングの半径は、MATLAB ワークフローによって生成されたプロットによって与えられるリングの中心から Rext までの距離によって決定されます。 3次元ANXAリング半径の計算ステップ 5.1 と同じ MATLAB 解析ワークフローを使用して、z 方向の ANXA リング半径の変化を追跡します。このワークフローを、 図3C、Eに示すように、膜巻線を横切るいくつかの共焦点zセクションに適用します。 図3Fに示すように、z断面の半径の変化に基づいて、各創傷の傾きを計算します。 ANXAリング半径の時間発展同様に、ステップ 5.1 の MATLAB 解析ワークフローを使用して、熱プラズモニック膜穿刺後の ANXA リングの ANXA リングの進化を追跡します。連続する時点を解析して、 図3D、G、Hに示すように、時間の経過に伴う変化を監視します。