Iniezione intratecale di topo neonato per l'editing del genoma e la somministrazione di farmaci
Summary
Il presente protocollo delinea le istruzioni passo-passo per l’esecuzione di iniezioni intratecali nei topi neonatali per l’editing genetico e la somministrazione di farmaci.
Abstract
L’iniezione intratecale è una procedura comunemente impiegata sia nelle cliniche pediatriche che in quelle per adulti, che funge da mezzo efficace per somministrare farmaci e trattamenti. Somministrando direttamente farmaci e trattamenti nel liquido cerebrospinale del sistema nervoso centrale, questo metodo consente di ottenere concentrazioni localizzate di farmaci più elevate, riducendo al contempo gli effetti collaterali sistemici rispetto ad altre vie come le iniezioni endovenose, sottocutanee o intramuscolari. La sua importanza va oltre le impostazioni cliniche, poiché l’iniezione intratecale svolge un ruolo fondamentale negli studi preclinici incentrati sul trattamento dei disturbi neurogenetici nei roditori e in altri animali di grandi dimensioni, compresi i primati non umani. Tuttavia, nonostante la sua ampia applicazione, l’iniezione intratecale nei cuccioli giovani, in particolare neonatali, pone sfide tecniche significative a causa delle loro piccole dimensioni e della loro natura fragile. Una somministrazione efficace e affidabile di iniezioni intratecali nei topi neonati richiede una meticolosa attenzione ai dettagli e un’attenta considerazione di vari fattori. Pertanto, c’è un bisogno cruciale di un protocollo standardizzato che non solo fornisca istruzioni, ma evidenzi anche le considerazioni tecniche chiave e le buone pratiche di laboratorio per garantire la coerenza procedurale, nonché la sicurezza e il benessere degli animali.
Per rispondere a questa esigenza insoddisfatta, presentiamo un protocollo dettagliato e completo per l’esecuzione di iniezioni intratecali specifiche nei cuccioli appena nati il giorno 1 postnatale (P1). Seguendo le istruzioni passo-passo, i ricercatori possono eseguire con sicurezza iniezioni intratecali nei cuccioli neonatali, consentendo la somministrazione accurata di farmaci, oligo antisenso e virus per la sostituzione genica o trattamenti basati sull’editing del genoma. Inoltre, viene sottolineata l’importanza di aderire alle buone pratiche di laboratorio per mantenere il benessere degli animali e garantire risultati sperimentali affidabili. Questo protocollo mira ad affrontare le sfide tecniche associate alle iniezioni intratecali nei topi neonatali, facilitando in ultima analisi i progressi nel campo della ricerca neurogenetica che mira a sviluppare potenziali interventi terapeutici.
Introduction
L’iniezione intratecale (IT) è una procedura clinica comune utilizzata per somministrare farmaci, raccogliere liquido cerebrospinale e mantenere la pressione intracranica sia nei pazienti pediatrici che in quelli adulti nelle cliniche 1,2. La somministrazione di farmaci tramite iniezione intratecale è un approccio efficace per aumentare le concentrazioni di farmaci nel sistema nervoso centrale (SNC) riducendo al minimo l’esposizione sistemica. Di conseguenza, questo metodo migliora l’efficacia terapeutica e riduce gli effetti collaterali, in particolare per i farmaci sensibili alla temperatura e a breve emivita3.
Negli studi preclinici che testano nuovi farmaci e trattamenti utilizzando modelli di roditori, è imperativo utilizzare un metodo affidabile di somministrazione dei farmaci che offra maggiore precisione e riproducibilità dei risultati 4,5. Per gli studi preclinici che valutano nuovi trattamenti per i disturbi neurogenetici e del neurosviluppo, il trattamento precoce è fondamentale per gli studi iniziali proof-of-concept perché si prevede che gli interventi precoci producano risultati più favorevoli 6,7,8.
Rispetto alle iniezioni intracerebroventricolari convenzionali (ICV), le iniezioni di IT comportano rischi significativamente inferiori poiché ovviano alla necessità di penetrazione diretta attraverso la corteccia cerebrale. Questo vantaggio riduce sostanzialmente il potenziale danno al tessuto corticale regionale e ai nervi circostanti. Inoltre, le iniezioni di IT consentono un aumento di almeno cinque volte del volume somministrabile di farmaci attraverso una singola iniezione, migliorando notevolmente la fattibilità di somministrazioni ripetute. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni e della natura fragile dei topi appena nati, l’esecuzione di iniezioni intratecali nei cuccioli appena nati è tecnicamente impegnativa e richiede tecniche specializzate, attrezzature e una manipolazione meticolosa.
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato con istruzioni dettagliate per l’esecuzione di iniezioni intratecali nei cuccioli neonati P1. Le considerazioni chiave e le buone pratiche di laboratorio sono qui enfatizzate per garantire la coerenza della somministrazione e la sicurezza e il benessere degli animali durante la procedura. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono condurre esperimenti con sicurezza con precisione e riproducibilità, riducendo al minimo qualsiasi potenziale rischio o disagio per gli animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene descritta una procedura passo-passo per l’iniezione intratecale nei topi neonatali (P1), con conseguente distribuzione diffusa del farmaco nel loro cervello. Rispetto al comune metodo di iniezione intracerebroventricolare per la somministrazione di farmaci ai topi neonatali, che prevede la perforazione della corteccia cerebrale11, l’iniezione intratecale evita lesioni dirette al cervello del topo neonatale a causa della penetrazione dell’ago. A causa della minima invasività, l’iniezione int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XNL è supportato dalla borsa di studio post-dottorato della Fondazione per la terapia della sindrome di Angelman (FAST). YHJ è anche supportato da FAST e NIH Grant R01HD110195 e R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
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