Optogenetisk manipulering av signalveier kan være en kraftig strategi for å undersøke hvordan signalering dekodes i utvikling, regenerering, homeostase og sykdom. Denne protokollen gir praktiske retningslinjer for bruk av lys-oksygen-spenning sensing domenebasert Nodal og bein morfogent protein (BMP) signalaktivatorer i tidlig sebrafisk embryo.
Signalveier orkestrerer grunnleggende biologiske prosesser, inkludert utvikling, regenerering, homeostase og sykdom. Metoder for eksperimentell manipulering av signalering er nødvendig for å forstå hvordan signalering tolkes i disse omfattende sammenhenger. Molekylære optogenetiske verktøy kan gi reversible, justerbare manipulasjoner av signalveiaktivitet med høy grad av spatiotemporal kontroll og har blitt brukt in vitro, ex vivo og in vivo. Disse verktøyene kobler lysresponsive proteindomener, for eksempel det blå lyset homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) -domenet, med signaleffektorer for å gi lysavhengig eksperimentell kontroll over signalering. Denne protokollen gir praktiske retningslinjer for bruk av det LOV-baserte benmorfogenetiske proteinet (BMP) og Nodal-signalaktivatorene bOpto-BMP og bOpto-Nodal i det optisk tilgjengelige tidlige sebrafiskembryoet. Den beskriver to kontrolleksperimenter: En rask fenotypeanalyse for å bestemme passende eksperimentelle forhold, og en immunfluorescensanalyse for å direkte vurdere signalering. Sammen kan disse kontrolleksperimentene bidra til å etablere en rørledning for bruk av optogenetiske verktøy i tidlige sebrafiskembryoer. Disse strategiene gir en kraftig plattform for å undersøke rollene til signalering i utvikling, helse og fysiologi.
Signalveier tillater celler å reagere på sitt miljø og koordinere aktiviteter på vevs- og organismeskala. Signaler som er avgjørende for embryonal utvikling inkluderer TGF-beta superfamiliemedlemmene bein morfogenetisk protein (BMP) og Nodal 1,2,3. Under embryogenese mønstrer veiene som reguleres av disse signalene og andre kroppsplanen ved å kontrollere genuttrykk og tilleggsprosesser for å sikre at forskjellige vev og organer utvikler seg og grensesnitt riktig. Patologier, inkludert fødselsskader og kreft, kan oppstå når signalering eller respons på signalering forstyrres 4,5,6,7. Til tross for grundige undersøkelser av signalering, gjenstår det mye mer å oppdage om hvordan nivåer og dynamikk dekodes i en rekke sammenhenger 8,9,10,11, spesielt under utvikling 12,13,14,15,16,17,18,19.
For å forstå hvordan signalering dekodes, ville et ideelt eksperiment være å manipulere signalnivåer, timing og / eller dynamikk – med høy grad av romlig og tidsmessig kontroll – og vurdere utfall. For eksempel foreslås presise romlige signalgradienter for å mønstre utviklende vev20,21. Endring av signalgradient romlige fordelinger vil bidra til å teste denne hypotesen22. I tillegg blir viktigheten av signaldynamikk for å generere forskjellige cellulære responser tydeligere: Den samme signalveien kan instruere celler til å differensiere eller spre seg avhengig av signalfrekvens, for eksempel 9,23. Eksperimentelle paradigmer der signaldynamikk lett kan manipuleres, vil være verdifulle for å utforske forholdet mellom dynamikk og celleskjebnebeslutninger 8,12,13,14,15.
Historisk har flere metoder blitt brukt til å manipulere signalering i utviklingssammenhenger, noe som har ført til grunnleggende funn 1,2,3. Signalering kan blokkeres ved hjelp av mutanter med tap av funksjon, ektopisk inhibitoruttrykk eller antagonistmedikamenter. Metoder for å aktivere signalering inkluderer agonistmedikamenter, rekombinante ligander, ektopisk ekspresjon av ligander eller konstitutivt aktive reseptorer, og pathway inhibitor loss-of-function mutanter. Disse metodene spenner langs et kontinuum av eksperimentell kontroll. For eksempel kan mutanter og ektopisk uttrykk falle på sleggesiden av kontinuumet: Med disse tilnærmingene kan dramatiske, systemiske endringer i baneaktivitet forårsake tidlig død og utelukke undersøkelser på senere stadier, eller over tid kan det resultere i pleiotropiske effekter som er vanskelige å skille ut. I tillegg er det ofte utfordrende å uavhengig manipulere en signalfunksjon om gangen, for eksempel nivå eller varighet. Mot den andre enden av kontinuumet tilbyr noen metoder mer presis eksperimentell kontroll, for eksempel mikrofluidiske enheter som utsetter prøver for legemidler eller rekombinante proteiner med tidsmessig og noen ganger romlig kontroll 18,24,25, eller genetiske metoder, inkludert varmesjokkinduserbare og vevsspesifikke promotorer som kan tilby lignende fordeler16,26,27. Disse metodene kan imidlertid være vanskelige å utføre, kanskje ikke reversible, kan ha relativt langsom kinetikk eller dårlig oppløsning, og kan være utilgjengelige i enkelte modellsystemer.
Molekylære optogenetiske tilnærminger er et kraftig tillegg til denne verktøykassen. Disse tilnærmingene bruker proteiner som reagerer på forskjellige lysbølgelengder for å manipulere biologiske prosesser, inkludert signalering 8,12,13,14,15, og har blitt utviklet over flere tiår for bruk i en rekke systemer fra cellekultur til hele dyr 12,13,28. Sammenlignet med historiske tilnærminger kan molekylær optogenetikk ofte tilby en høyere grad av spatiotemporal kontroll over biologiske prosesser: Kontrolleren i optogenetiske systemer er lett, og kontroll av lysbølgelengde, intensitet, varighet og eksponeringsfrekvens er relativt enkel. Med sofistikerte systemer som konfokale og to-foton mikroskoper, er romlig kontroll i det subcellulære området mulig 29,30,31. Verktøy for å optogenetisk manipulere signalering har blitt utviklet og anvendt i flere systemer, inkludert de som er beskrevet i Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 og Huang et al.34. For eksempel, ved å utnytte den romlige kontrollen som optogenetikk gir, ble denne strategien nylig brukt til å modifisere en signalgradient i Drosophila-embryoer, noe som viser at flueembryogenese er overraskende robust mot endringer i denne gradienten22. Reversibiliteten og den raske av/på-kinetikken til optogenetiske signalaktivatorer har også gjort dem til attraktive verktøy for å undersøke dekoding av signaldynamikk 8,12,13,14,15,34,35,36.
Det tidlige sebrafiskembryoet er et in vivo-system som er godt egnet for optogenetiske studier fordi det er eksternt befruktet, gjennomsiktig, mikroskopivennlig og genetisk håndterbart. Lyseksponering er lettere å levere til embryoer som utvikler seg utenfor moren, lys kan trenge inn og få tilgang til deres ikke-ugjennomsiktige vev, levende sebrafiskembryoer tåler avbildning godt (i tillegg til å være gjennomsiktige), og eksisterende genetiske metoder gir enkle muligheter for knockdown og overuttrykkseksperimenter, i tillegg til utvikling av nyttig transgenikk 37.
Nylig ble det utviklet optogenetiske verktøy for å aktivere BMP38– og Nodal39-signalering i sebrafiskembryoer med eksponering for blått lys (figur 1). Vi omtaler disse verktøyene som bOpto-BMP og bOpto-Nodal (b for blått lys aktivert og Opto for optogenetisk). bOpto-BMP/Nodal er basert på lignende aktiveringsmekanismer. Bindingen av BMP eller Nodal-ligander til deres respektive reseptor-serin-treoninkinaser driver reseptorkinasedomeneinteraksjoner som fører til fosforylering av signaleffektorer (Smad1/5/9 for BMP og Smad2/3 for Nodal). Fosforylerte signaleffektorer translokerer deretter til kjernen og regulerer målgenuttrykk3 (figur 1A, D). Disse reseptorkinaseinteraksjonene kan gjøres lysresponsive ved å koble reseptorkinaser til lysresponsive dimeriserende proteiner: Ved lyseksponering bør disse kimære proteinene dimerisere, noe som får reseptorkinasedomenene til å interagere og aktivere signalering (figur 1B, C, E, F). Det er viktig å merke seg at i motsetning til endogene reseptorer inneholder bOpto-BMP/Nodal ikke ekstracellulære ligandbindende domener, noe som sikrer liganduavhengig aktivitet (figur 1C,F). Denne optogenetiske aktiveringsstrategien ble først oppnådd med reseptortyrosinkinaser40,41,42 og deretter anvendt på reseptorserin-treoninkinaser.
bOpto-BMP/Nodal bruker det blå lysresponsive (~450 nm) homodimeriserende lys-oksygen-spenningssensor-domenet (LOV) fra algen Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Disse konstruksjonene består av et membranrettet myristoyleringsmotiv etterfulgt av enten BMP- eller nodalreseptorkinasedomener, smeltet sammen med et LOV-domene (figur 1B,E). Eksponering for blått lys bør forårsake LOV-homodimerisering, noe som resulterer i reseptorkinasedomeneinteraksjoner som fører til respektive Smad-fosforylering og baneaktivering (figur 1C,F). For bOpto-BMP ble en kombinasjon av konstruksjoner med type I-reseptorkinasedomenene fra Acvr1l (også kjent som Alk8) og BMPR1aa (også kjent som Alk3) og type II-reseptorkinasedomenet fra BMPR2a funnet å aktivere signalering38 optimalt (Addgene #207614, #207615 og #207616). For bOpto-Nodal brukes en kombinasjon av konstruksjoner med type I-reseptorkinasedomenet fra Acvr1ba og type II-reseptorkinasedomenet fra Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal har blitt introdusert i tidlige sebrafiskembryoer ved å injisere mRNA på encellestadiet, og brukes til å undersøke rollen til signalvarighet i Nodal tolkning39, for å avgjøre hvorfor sebrafisk mister evnen til å reagere på Nodal45, og for å undersøke hvordan BMP-målgener reagerer på forskjellige BMP-signalnivåer38. Det er sannsynlig at disse verktøyene vil fortsette å være nyttige i et mangfoldig utvalg av fremtidige undersøkelser. Styrken til optogenetiske signalaktivatorer er imidlertid også deres svakhet: lysfølsomme prøver må behandles med forsiktighet for å unngå utilsiktet ektopisk signalaktivitet. Eksponering for romlys eller sollys kan aktivere bOpto-BMP/Nodal.
Denne protokollen gir praktiske forslag til bruk av mRNA-kodede LOV-baserte BMP- og Nodal-aktivatorer i tidlige sebrafiskembryoer. Den begynner med å detaljere en strategi for å bygge en lysboks for å kontrollere jevn lyseksponering og temperatur (figur 2, tilleggsfil 1, tilleggsfil 2, tilleggsfil 3, tilleggsfil 4, tilleggsfil 5, tilleggsfil 6, tilleggsfil 7, tilleggsfil 8). Den beskriver deretter to viktige kontrolleksperimenter som bestemmer om en optogenetisk signalaktivator oppfører seg som forventet, dvs. aktiverer baneaktivitet bare når den utsettes for lys (figur 3). Den første kontrollanalysen innebærer å undersøke fenotyper en dag etter befruktning i lyseksponerte og ueksponerte embryoer (figur 3A). mRNA-injiserte lyseksponerte embryoer, men ikke ueksponerte embryoer, bør fenokopi BMP eller nodal overekspresjon (figur 4A,B; Spesielt BMP-fenotyper kan tydelig skilles på dette tidspunktetpunkt 46). Denne analysen gir en rask aktivitetsavlesning. I den andre kontrollanalysen, for å avgjøre om fenotyper er forårsaket spesifikt av overflødig BMP- eller Nodal-signalering og for direkte å observere endringen i signalnivåer, brukes immunfluorescensfarging til å oppdage fosforylerte signaleffektorer (henholdsvis pSmad1/5/9 eller pSmad2/3) etter en 20 min lyseksponering rundt sen blastula / tidlig gastrulasjonsstadium, når signalaktiviteten er godt beskrevet12, 16,17,47,48,49,50 (figur 3B og figur 4C). (Merk at selv om romlig lokalisert aktivering er demonstrert for både bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39, beskriver denne protokollen bare ensartet lyseksponering og signalaktiveringsstrategier.) Det anbefales å utføre disse kontrolleksperimentene før bOpto-BMP/Nodal brukes på spesifikke forskningsspørsmål for å bestemme ideelle lokale eksperimentelle forhold.
Injeksjon av mRNA er den nåværende strategien for å levere bOpto-BMP/Nodal til sebrafiskembryoer. Denne metoden har flere ulemper. For det første varierer riktig mengde mRNA mellom laboratorier. Mengden som brukes skal være tilstrekkelig til å aktivere signalering robust med lyseksponering, men uten utilsiktet mørk aktivering. Det er en god ide å teste flere mengder for å finne optimale mRNA-nivåer, og når de er etablert, lage alikoter av en masterblanding for reproduserbart å introdusere samme mengde mRNA. For det andre kan ujevn fordeling av injisert mRNA føre til ujevn signalaktivering. Injisering i midten av cellen (ikke eggeplommen) antas å fremme jevn mRNA-distribusjon. Til slutt, fordi injisert mRNA nedbrytes over tid, kan denne tilnærmingen ikke være egnet for eksperimenter i eldre embryoer. I fremtiden kan disse problemene løses ved at transgene sebrafisklinjer allestedsnærværende uttrykker bOpto-BMP/Nodal med en maternell eller medikamentinduserbar promotor. Selv om arbeid med potensielt lysfølsomme voksne sebrafisk kan være en utfordring i denne sammenhengen, har sebrafisk 61,62 og Drosophila 22,34,35,63 transgene som inneholder optogenetiske verktøy blitt utviklet.
Å unngå utilsiktet fotoaktivering er en generell utfordring med optogenetiske verktøy. For enkelhets skyld, behandle injiserte embryoer eldre enn 1,5 hpf som lysfølsomme. Utilsiktet lyseksponering kan ofte unngås ved ganske enkelt å pakke inn tallerkener eller tallerkener med aluminiumsfolie. For eksperimenter som krever visuell observasjon av levende embryoer eldre enn 1,5 hpf, er det imidlertid mulig å bruke røde lyskilder eller å dekke hvite lyskilder med billig gelfilterpapir som blokkerer LOV-dimeriserende bølgelengder (Table of Materials).
Lysboksen som beskrives her, er designet for spesifikke bruksområder som krever presis kontroll over lysstrålingsnivåer, dynamikk og bølgelengder (figur 2). Andre fordeler med denne lysboksen inkluderer jevn lyseksponering, ubetydelig utilsiktet prøveoppvarming, god plass til flere 6-brønnsplater og langlivede, spektralt godt karakteriserte lyskilder. Imidlertid kan forskjellige lyseksponeringsstrategier være å foretrekke, avhengig av forskningsapplikasjonen. Mange laboratorier har utviklet enklere og mer kostnadseffektive ensartede lyseksponeringssystemer med mindre fotavtrykk, inkludert fôrinkubatorer med LED-striper, suspendering av LED-paneler over prøver, eller inkorporering av lysdioder i oppvasklokk 32,38,39,40,64,65,66 . Det er viktig at lysboksen som brukes i denne protokollen ikke tillater brukere å selvstendig regulere individuelle brønner (i motsetning til Bugaj et al.52) eller gi romlig kontroll over lyseksponering. Romlig lokalisert optogenetisk aktivering har blitt demonstrert med bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39 ved bruk av lasere i henholdsvis SPIM- eller konfokale systemer, og har også blitt realisert med mange andre optogenetiske strategier i en rekke modellsystemer (diskutert i Rogers og Müller12). Noen tilnærminger har til og med oppnådd subcellulær romlig oppløsning 29,30,31. Selv om implementeringen av romlig lokaliserte lyseksponeringssystemer er utenfor omfanget av denne protokollen, er romlige aktiveringseksperimenter med bOpto-BMP / Nodal teoretisk mulig med spesialutstyr som digitale mikromirror-enheter eller maskeringsmetoder. Leserne oppfordres til å utforske den omfattende litteraturen om DIY-lysbokser for optogenetiske eksperimenter før de forplikter seg til en lyseksponeringsstrategi (se f.eks. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar og Khammash 53 og mer på https://www.optobase.org/materials/).
Molekylære optogenetiske strategier tilbyr ofte en høyere grad av spatiotemporal kontroll over biologiske prosesser sammenlignet med historiske tilnærminger som mutanter, ektopisk genuttrykk, rekombinante proteiner og legemidler. Lesere som er interessert i fordelene med optogenetiske tilnærminger, kan utforske andre publiserte verktøy som er tilgjengelige i sebrafisk og andre organismer. Disse inkluderer verktøy for å manipulere ytterligere signalveier 32,65,67,68, regulere genuttrykk 61,64,66,69,70,71, endre proteinlokalisering 31,72 og aktivere apoptose 62. Disse verktøyene og mange andre er beleilig katalogisert på OptoBase, en kuratert nettressurs for molekylære optogenetikktilnærminger28. For de som er inspirert til å lage nye optogenetiske verktøy, inneholder ressursen også nyttige beskrivelser av lysresponsive proteiner som har blitt brukt i et bredt spekter av strategier, inkludert lysresponsive proteiner som reagerer på grønne, røde og nær-infrarøde bølgelengder. Vi er glade for at det vitenskapelige samfunnet skal realisere det fulle potensialet for molekylære optogenetiske tilnærminger.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering for denne protokollen ble gitt av NICHD Intramural Program til KWR (ZIA HD009002-01). Vi takker Jeff Farrell og hans laboratorium for deres opplysende tilbakemeldinger, Will Anderson for utmerket teknisk støtte, Leanne Iannucci for stresstesting av protokollen og måling av bestråling, og NIH Shared Zebrafish-anlegget for deres harde arbeid med å holde sebrafisken sunn.
Building a light box & Light exposure protocol | |||
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
Generating mRNA | |||
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
Injecting mRNA | |||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |