Modelagem Inicial de Nicho Neurovascular Organoide Cerebral Humano Não Guiado na Membrana Corioalantóide Permissiva do Embrião de Pinto
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para enxertar organoides cerebrais humanos em múltiplos estágios de maturação na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos. Os organoides cerebrais foram cultivados seguindo protocolos padronizados não guiados.
Abstract
A enxertia de organoides em tecidos vascularizados em animais modelo, como a membrana corioalantóide (CAM) imunodeficiente de camundongos ou embriões de pintinhos, tem se mostrado eficiente para a modelagem da neovascularização. A CAM é uma membrana extraembrionária ricamente vascularizada, que apresenta imunorreatividade limitada, tornando-se um excelente modelo hospedeiro para transplantes de células de origem humana.
Este trabalho descreve a estratégia para enxertar organoides cerebrais humanos diferenciados em múltiplos estágios de maturação no MAC. A composição celular dos organoides cerebrais muda com o tempo, refletindo os marcos do desenvolvimento do cérebro humano. Nós enxertamos organoides cerebrais em estágios de maturação relevantes: expansão neuroepitelial (18 DIV), neurogênese precoce (60 DIV) e gliogênese precoce (180 DIV) na CAM de embriões embrionários dia (E)7 de galinha. Organoides cerebrais enxertados foram colhidos 5 dias depois e suas características histológicas foram analisadas.
Não foram detectados sinais histológicos de neovascularização nos organoides enxertados ou vasos sanguíneos anormais adjacentes aos enxertos. Além disso, mudanças marcantes foram observadas na composição celular dos organoides enxertados, a saber, um aumento no número de astrócitos gliais fibrilares ácidos-positivos-reativos. Entretanto, as alterações citoarquiteturais foram dependentes do estágio de maturação dos organoides. Em conjunto, esses resultados sugerem que organoides cerebrais podem crescer no MAC e mostram diferenças na citoarquitetura dependendo do estágio de maturação na enxertia.
Introduction
Os organoides cerebrais humanos são uma técnica emergente que nos permite recapitular in vitro o desenvolvimento inicial do cérebro humano 1,2,3. No entanto, uma das principais limitações desse modelo é a falta de vascularização, que desempenha papéis indispensáveis não só na homeostase cerebral, mas também no desenvolvimentocerebral4. Além da oferta de oxigênio e nutrientes, evidências acumuladas sugerem que o sistema vascular cerebral regula a diferenciação neural, migração e sinaptogênese durante o desenvolvimento 5,6. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer modelos confiáveis que possam fornecer a sinalização e a estrutura vascular ausente aos organoides cerebrais, aumentando a complexidade da geração de organoides cerebrais humanos7.
Dentre os métodos de vascularização propostos, duas principais linhas de atuação podem ser consideradas: enxertia organoide em organismo vivo e tecnologias puramente in vitro co-cultivando células endoteliais e neurais8,9,10,11,12. O transplante intracerebral em camundongos é caro e demorado, tornando outras tecnologias relevantes para modelos mais simples. O ensaio de membrana corioalantóide (CAM) em pintinhos tem sido amplamente utilizado para estudar a angiogênese 13,14,15. Na última década, vários grupos enxertaram com sucesso diferentes tipos de organoides, incluindo organoidesrenais16,17, cardíacos18 e tumorais19,20, em CAMs. No entanto, pouco se sabe sobre a eficácia, toxicidade/rejeição, efeito fisiológico e métodos para enxertar organoides cerebrais humanos no CAM. Outro aspecto interessante e ainda inexplorado é a formação de uma barreira hematoencefálica quimérica (BHE) entre as MAC e a interface astrocitária organoide. Trabalhos pioneiros anteriores sugeriram a viabilidade putativa de gerar uma BBB na CAM por meio do transplante de astrócitos e meio condicionado por astrócitos 21,22,23. No entanto, astrócitos maduros parecem ser incapazes de atingir esseobjetivo 24,25. Assim, a formação induzida por astrócitos do BBB permanece discutível, e o transplante de organoides cerebrais humanos nos permitiria lançar luz sobre essa controvérsia.
Este artigo em vídeo descreve um protocolo para um transplante in ovo de organoides cerebrais humanos em CAM que promove crescimento, melhora e vascularização, resultando em organoides que englobam elementos BBB histologicamente compatíveis. Aqui, apresentamos um protocolo garantindo a sobrevivência do embrião de galinha e relatamos a permissividade da CAM para sustentar o crescimento organoide cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado com inúmeras etapas fundamentais que proporcionam crescimento e desenvolvimento favoráveis de organoides cerebrais humanos após a enxertia sem perturbar a sobrevivência dos embriões de galinha. Recomendamos o uso de agulhas estéreis para puncionar a câmara de ar do ovo após 24 h de incubação (dia 1). Além disso, também tentamos fazer a punção no 4º dia (após verificar a casca do ovo com luz para testar o desenvolvimento da vasculatura para ter certeza de qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Alcántara e ao Dr. Ortega do UB e ao resto dos membros do laboratório do Dr. Acosta pelas discussões perspicazes. S.A. é professor assistente da Generalitat de Catalunya da Universitat de Barcelona.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
