Erken Güdümsüz İnsan Beyni Organoid Nörovasküler Niş İzin Veren Civciv Embriyo Korioallantoik Membran Modellemesi
Summary
Burada, insan beyni organoidlerini çoklu olgunlaşma aşamalarında civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılamak için bir protokol sunuyoruz. Beyin organoidleri, kılavuzsuz standartlaştırılmış protokoller izlenerek büyütüldü.
Abstract
İmmün yetmezliği olan fare veya civciv embriyosu koryoallantoik membran (CAM) gibi model hayvanlarda organoidlerin vaskülarize dokulara aşılanmasının neovaskülarizasyon modellemesi için etkili olduğu kanıtlanmıştır. CAM, sınırlı immünoreaktivite gösteren, zengin vaskülarize ekstraembriyonik bir zardır ve böylece insan kaynaklı hücre nakilleri için mükemmel bir barındırma modeli haline gelir.
Bu makale, çoklu olgunlaşma aşamalarında farklılaşmış insan beyni organoidlerini CAM’a aşılama stratejisini açıklamaktadır. Beyin organoidlerinin hücresel bileşimi, insan beyninin gelişiminin kilometre taşlarını yansıtacak şekilde zamanla değişir. Beyin organoidlerini ilgili olgunlaşma aşamalarında aşıladık: nöroepitelyal genişleme (18 DIV), erken nörojenez (60 DIV) ve erken gliogenez (180 DIV) embriyonik gün (E) 7 tavuk embriyolarının CAM’sine. Engrafted beyin organoidleri 5 gün sonra toplandı ve histolojik özellikleri analiz edildi.
Aşılanmış organoidlerde veya greftlere bitişik anormal kan damarlarında neovaskülarizasyonun histolojik belirtisi tespit edilmedi. Ayrıca, aşılanmış organoidlerin hücresel bileşiminde, yani glial fibriler asidik protein-pozitif-reaktif astrositlerin sayısında bir artış gözlenmiştir. Bununla birlikte, sitomimari değişiklikler organoid olgunlaşma aşamasına bağlıydı. Toplamda, bu sonuçlar beyin organoidlerinin CAM’de büyüyebileceğini ve aşılamadaki olgunlaşma aşamalarına bağlı olarak sitomimaride farklılıklar gösterdiğini göstermektedir.
Introduction
İnsan beyni organoidleri, insan beyninin erken gelişimini in vitro 1,2,3 olarak özetlememizi sağlayan yeni bir tekniktir. Bununla birlikte, bu modelin en büyük sınırlamalarından biri, sadece beyin homeostazında değil, aynı zamanda beyin gelişiminde de vazgeçilmez rol oynayan vaskülarizasyon eksikliğidir4. Oksijen ve besin maddelerinin verilmesine ek olarak, biriken kanıtlar, beynin vasküler sisteminin gelişim sırasında nöral farklılaşmayı, göçü ve sinaptogenezi düzenlediğini göstermektedir 5,6. Bu nedenle, beyin organoidlerine eksik vasküler sinyalleme ve yapı sağlayabilecek ve insan beyni organoid neslininkarmaşıklığını artırabilecek güvenilir modeller oluşturmaya acil bir ihtiyaç vardır 7.
Vaskülarizasyon için önerilen yöntemler arasında iki ana akım düşünülebilir: canlı bir organizmaya organoid aşılama ve tamamen in vitro teknolojiler endotel hücrelerini ve sinir hücrelerini birlikte kültürleyen 8,9,10,11,12. Farelerde intraserebral transplantasyon maliyetli ve zaman alıcıdır, bu da diğer teknolojileri daha basit modeller için uygun hale getirir. Civciv koryoallantoik membran (CAM) testi, anjiyogenezi incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır 13,14,15. Son on yılda, birkaç grup, böbrek16,17, kardiyak18 ve tümör organoidleri19,20 dahil olmak üzere farklı organoid türlerini TAT’lere başarıyla aşılamıştır. Bununla birlikte, insan beyni organoidlerini CAM’a aşılamanın etkinliği, toksisitesi / reddi, fizyolojik etkisi ve yöntemleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Bir başka ilginç ve henüz keşfedilmemiş husus, CAM ve organoid astrositik arayüz arasında kimerik bir kan-beyin bariyerinin (BBB) oluşmasıdır. Önceki öncü çalışmalar, astrositleri ve astrosit koşullu ortamı 21,22,23 naklederek CAM’de bir BBB üretmenin varsayılan fizibilitesini önerdi. Bununla birlikte, olgun astrositler bu 24,25’i başaramıyor gibi görünmektedir. Bu nedenle, BBB’nin astrosit kaynaklı oluşumu tartışmalıdır ve insan beyni organoidlerinin nakli bu tartışmaya ışık tutmamızı sağlayacaktır.
Bu video makalesinde, histolojik olarak uyumlu BBB elemanlarını kapsayan organoidlerle sonuçlanan, büyümeyi, iyileşmeyi ve vaskülarizasyonu destekleyen CAM’ye in ovo insan beyni organoid nakli için bir protokol açıklanmaktadır. Burada, tavuk embriyosunun hayatta kalmasını sağlayan bir protokol sunuyoruz ve beyin organoid büyümesini sürdürmek için CAM’ın izin verilebilirliğini rapor ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, tavuk embriyolarının hayatta kalmasını bozmadan, aşılama üzerine insan beyni organoidlerinin olumlu büyümesini ve gelişmesini sağlayan çok sayıda anahtar adımdan oluşan ayrıntılı bir protokol tanımladık. 24 saatlik inkübasyondan sonra (1. gün) yumurtanın hava odasını delmek için steril iğnelerin kullanılmasını önerdik. Ek olarak, 4. günde de delinmeye çalıştık (sadece sağlıklı embriyolarla çalıştığımızdan emin olmak için damar sisteminin gelişimini test etm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UB’den Dr. Alcántara ve Dr. Ortega’ya ve Dr. Acosta’nın laboratuvarındaki diğer üyelere anlayışlı tartışmalar için teşekkür ederiz. S.A., Universitat de Barcelona’daki Generalitat de Catalunya’dan Serra-Hunter yardımcı doçentidir.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
