Label-free Amyloid Structural Characterization을 위한 편광에 민감한 2광자 현미경

지난 수십 년 동안 단백질과 그 응^집체1의 바이오이미징을 위한 수많은 형광 현미경 기술이 크게 발전했지만, 샘플 ^2,3 내에서 국소 순서를 확인하는 데 사용된 것은 소수에 불과합니다. 형광 수명 이미징 현미경⁴는 아밀로이드 상부 구조-구형석의 고유한 구조적 이질성을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 구형석(spherulites)과 같은 복잡하고 조밀하게 포장된 생물구조 내부의 국소 질서에 대한 정량적 결정은 편광에 민감한 방법을 사용하여 해결할 수 있습니다³. 그러나 UV-VIS 파장을 사용하여 생체 내 형광단을 여기시키면 조직 광 산란이 높기 때문에 표면 조직 침투를 사용하는 표준 형광 기술은 제한적입니다⁵. 또한 이러한 이미징은 종종 특정 형광 프로브를 설계하고 표적 생체 분자에 바인딩해야 하므로 이미징을 수행하는 데 필요한 비용과 작업량이 증가합니다.

최근 이러한 문제를 해결하기 위해 우리 팀은 생물학적 구조의 무표지 이미징을 위해 편광 민감성 이광자 여기 형광 현미경(ps-2PFM)을 채택했습니다 ^6,7. Ps-2PFM은 여기 빔의 선형 편광 방향에 대한 이광자 형광 강도의 의존성을 측정하고 방출된 형광⁸의 편광을 분석할 수 있습니다. 이 기술을 구현하려면 표준 다광자 현미경 설정 여기 경로(그림 1)를 반파장 플레이트로 보완하여 광 편광면을 제어해야 합니다. 그런 다음 여기 레이저 빔의 편광에 대한 이광자 여기 형광 강도의 의존성을 나타내는 극좌표 그래프가 두 개의 애벌랜치 포토다이오드에 의해 수집된 신호에서 생성되어 형광 편광의 두 개의 상호 수직 구성 요소를 수집합니다.

마지막 단계는 데이터 분석 프로세스로, dichroic mirrors 또는 high numerical aperture objective와 같은 광학 요소가 편광에 미치는 영향을 고려합니다. 이광자 공정의 특성으로 인해 이 방법은 초점면 외부의 형광단의 이광자 여기가 확률적으로 제한되기 때문에 각도 광선택이 감소하고 축 분해능이 향상됩니다. 또한 심부 조직 이미징을 위한 근적외선 프로브(NIR)의 생체 내 이미징에 대해 유사한 방법을 성공적으로 구현할 수 있음이 입증되었습니다⁹. Ps-2PFM은 이전에 세포막¹⁰ 및 DNA^11,12의 이미지 형광단뿐만 아니라 금 나노 입자¹³과 같은 생물학적 시스템의 비표준 형광 마커에 적용되었습니다. 그러나, 이 모든 예에서, 생체 분자의 조직에 관한 정보는 간접적으로 얻어졌고 형광단과 생체 분자 사이의 사전 정의된 상호 배향을 필요로 했습니다.

최근 논문 중 하나에서 우리는 ps-2PFM이 구형석의 아밀로이드 피브릴에 결합된 아밀로이드 특이적 염료인 Thioflavin T의 아밀로이드 상부 구조 및 형광의 자가형광 국소 분극을 결정하는 데 성공적으로 적용될 수 있음을 보여주었습니다⁶. 또한, 또 다른 연구에서는 ps-2PFM을 서브미크론 크기 영역에서 아밀로이드 구형 구형 내부의 아밀로이드 피브릴 배향을 검출하는 데 사용할 수 있음을 입증했으며, 이는 투과 전자 현미경(TEM) 이미징⁷과 연관시켜 확인되었습니다. 이 결과의 달성은 i) 하나 또는 두 개의 광자로 여기될 때 구형석-아밀로이드의 고유 자가형광이 450에서 500nm 범위에 위치한 방출 최대값 및 표준 형광 염료¹⁴와 유사한 이광자 흡수 단면을 나타내는 고유 자가형광을 나타내고, ii) 생물학적 막 및 DNA 구조를 표지하는 염료의 ps-2PEF가 어떻게 적용될 수 있는지 설명하기 위해 이전에 소개된 수학적 모델 덕분에 가능했습니다. 구형석과 염료에 의해 표시되는 형광 ^8,11,15. 따라서 분석을 진행하기 전에 이 주제⁶에 관한 첫 번째 논문의 본문과 지원 정보 모두에 설명된 필수 이론을 살펴보는 것이 좋습니다. 여기에서는 소 인슐린 구형석의 무표지 아밀로이드 구조적 특성 분석을 위해 ps-2PFM 기법을 적용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.